hITF基因治療腸源性感染的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 腸三葉因子(intestinAltrefoil factor，ITF)是由腸杯狀細(xì)胞特異分泌的小分子多肽，它的59個(gè)氨基酸序列中有一段特殊的核心結(jié)構(gòu)域，其間的6個(gè)半胱氨酸按特定(1-5，2-4和3-6)的順序，依次以二硫鍵兩兩相接，形成3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，整個(gè)肽鏈由此發(fā)生彎曲和折疊，形如“三葉草”，故名腸三葉因子(ITF)。ITF 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便受到廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注，大量的研究表明，ITF在腸黏膜的自我保護(hù)及修復(fù)機(jī)制中占據(jù)

2、重要地位。作為一個(gè)具有廣泛應(yīng)用前景的藥物前體，卻因?yàn)閺?fù)雜的制備過程、較低的產(chǎn)量限制了它的應(yīng)用?；蛑委熓墙陙沓霈F(xiàn)的嶄新的治療手段，是將人正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。若通過基因治療的途徑將ITF基因?qū)塍w內(nèi)，可以使ITF在體內(nèi)大量表達(dá)，有望簡(jiǎn)化繁瑣的操作程序、降低昂貴的生產(chǎn)成本。
　　 目的：
　　 篩選并構(gòu)建hITF 理想的

3、基因傳遞系統(tǒng)；探索hITF基因治療對(duì)燒傷后腸源性感染的作用。
　　 方法：
　　 1．首先從人小腸內(nèi)膜提取總RNA，再利用RT-PCR 技術(shù)獲得hITF信號(hào)肽及成熟肽cDNA，然后克隆至質(zhì)粒pEGFP-N1獲得重組載體，最后雙酶切及測(cè)序鑒定。
　　 2．利用復(fù)凝法制備殼聚糖納米粒，用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)及大小，以Zeta電位儀檢測(cè)不同N/P 比及pH對(duì)Zeta 電位的影響，瓊脂糖電泳分析納米粒對(duì)基因的包裹和保

4、護(hù)能力，并計(jì)算納米粒的包封率和載藥量，最后分析其釋放曲線。
　　 3．利用殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄情況，Western Blot 檢測(cè)hITF表達(dá)情況。
　　 4．將穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)、目的基因(pEGFP-N1-hITF)雙酶切，以T4DNA連接酶連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF。重組質(zhì)粒PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)

5、粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，PacⅠ酶切鑒定。重組腺病毒載體在HEK293細(xì)胞中包裝，根據(jù)Karbers 公式計(jì)算病毒顆粒滴度。
　　 5．將重組腺病毒感染人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29、Caco-2)，然后行RT-PCR及WB檢測(cè)，從轉(zhuǎn)錄及蛋白水平檢測(cè)hITF表達(dá)情況；感染病毒細(xì)胞做爬片后行細(xì)胞免疫熒光檢查；最后通過劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)重組腺病毒對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移功能的影響。
　　 6．．首先制備30％T

6、BSA Ⅲ°燒傷小鼠模型，并給予重組腺病毒灌胃，在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)取標(biāo)本檢測(cè)腸黏膜損傷指數(shù)、絨毛高度、隱窩深度、病理切片、冰凍切片、腸道菌群移位率以及血清LPS，以觀察Ad-hITF對(duì)小鼠燒傷后腸源性感染是否具有治療組用。
　　 結(jié)果：
　　 1．獲得hITF信號(hào)肽+成熟肽全長(zhǎng)基因序列，并成功插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1構(gòu)建出重組載體，雙酶切鑒定后送基因測(cè)序，結(jié)果證明目的基因與Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的基因序列完全一致

7、，遂命名為pEGFP-N1-hITF。
　　 2．利用復(fù)凝法制備了不同N/P 比的殼聚糖納米粒，透射電鏡觀察到粒度集中在300-500nm，粒徑呈窄分布；Zeta 電位與N/P 比呈正相關(guān)，而與pH值呈負(fù)相關(guān)；凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)說明殼聚糖在N/P 比大于1時(shí)可以完全包裹質(zhì)粒；DNA 保護(hù)實(shí)驗(yàn)說明納米?？梢员Ｗo(hù)內(nèi)部質(zhì)粒免受DNAse I的降解；包封率隨著N/P 比的增加而增加，載藥量則隨著N/P 比的增加而減小；體外釋放試驗(yàn)顯示，納米粒

8、釋放速度先快后滿，而且隨著N/P 比的增加而逐漸減慢。
　　 3．熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，殼聚糖納米粒對(duì)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率約為80％，和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率基本一致；RT-PCR和WB 檢測(cè)說明，hITF 被成功轉(zhuǎn)錄并分泌表達(dá)。
　　 4．成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF，PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組，PacⅠ酶切鑒定后命名為Ad-hITF；重組腺病毒載體在HEK2

9、93細(xì)胞中包裝，獲得重組腺病毒顆粒；根據(jù)Karbers 公式計(jì)算病毒顆粒滴度為2×109pfu/ml。
　　 5．重組腺病毒在MOI=50的滴度下可以感染人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29、Caco-2)，感染效率接近100％；RT-PCR和WB 檢測(cè)說明，hITF 被成功轉(zhuǎn)錄并分泌表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光顯示，hITF 可表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，但以細(xì)胞漿為主；劃痕實(shí)驗(yàn)證明感染重組腺病毒對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的促遷移能力。
　　 6．成

10、功制備了30％TBSA Ⅲ°燒傷小鼠模型，給予重組腺病毒灌胃后，燒傷小鼠腸黏膜損傷指數(shù)明顯低于B組，絨毛高度、隱窩深度顯著高于B組；病理切片提示Ad-hITF組損傷情況明顯較輕，冰凍切片顯示hITF 已表達(dá)于腸黏膜；腸道菌群移位率以及血清LPS 檢測(cè)提示，Ad-hITF組顯著低于B組。
　　 結(jié)論：
　　 1．基因測(cè)序證明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-hITF構(gòu)建成功。
　　 2．復(fù)凝法制備出殼聚糖納米粒，其

11、直徑小于500nm，Zeta 電位陽(yáng)性，能有效保護(hù)內(nèi)部基因。
　　 3．殼聚糖納米粒能高效轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并分泌表達(dá)出成熟hITF。
　　 4．成功構(gòu)建出含hITF基因的重組腺病毒載體Ad-hITF。
　　 5．Ad-hITF能高效感染結(jié)腸癌細(xì)胞，并分泌表達(dá)出成熟hITF，且對(duì)細(xì)胞遷移具有顯著的促進(jìn)作用。
　　 6．Ad-hITF 可顯明顯減輕燒傷小鼠腸黏膜損傷、促進(jìn)修復(fù)，對(duì)燒傷后腸源性感染具有良好