重組復制缺陷型腺病毒介導的人IL-24-MDA-7基因治療胰腺癌的體內外實驗研究.pdf

1、目的： 1．構建攜帶IL—24基因片段的重組復制缺陷型腺病毒Ad—IL—24，為探討治療胰腺癌的方法提供實驗基礎。 2．觀察重組腺病毒介導的IL—24基因對人胰腺癌細胞patu8988生長的抑制作用，探討IL—24抑制胰腺腫瘤生長的機理。 3．研究重組腺病毒介導的IL—24基因對小鼠髓系樹突狀細胞成熟活化的影響，探討IL—24基因在腫瘤免疫治療中的作用。 4．觀察重組腺病毒介導的IL—24基因對裸鼠體內胰

2、腺腫瘤生長的抑制作用，探討IL—24對胰腺癌的治療潛力。 方法：從Genbank中查得IL—24基因cDNA全長序列，選擇5’端轉錄起始位點附近長621bp的基因序列為目的基因片段，設計特異性克隆引物。從人外周血單個核細胞（PBMC）中提取總RNA，以總RNA為模板用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT—PCR）擴增IL—24基因片段。將經基因測

3、序證實為正確的基因片段反向克隆到重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)中的穿梭質粒pAdTrack—CMV的多克隆位點（multiple cloning site，MCS），構建攜帶IL—24基因片段的重組穿梭質粒pAdTrack—CMV—IL—24；再將pAdTrack—CMV—IL—24與重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)中的骨架質粒pAdEasy—1在大腸桿菌DH5a內進行同源重組，經293細胞包裝生成攜帶IL—24基因片段的重組腺病毒Ad—

4、IL—24，同時構建空病毒Ad—GFP。通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光數檢測綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的表達，測定Ad—IL—24和Ad—GFP的滴度。用感染復數（multiplicities of infection，MOI）為100的Ad—IL—24感染人胰腺癌細胞株patu8988，用Western blot、ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中IL—24的蛋白表達；用MTT法、流式細胞術

5、（FCM）分別檢測Ad—IL—24對人胰腺癌細胞株patu8988生長情況的影響。采用小鼠髓系樹突狀細胞（BMDCs）開展研究，從小鼠骨髓中獲取和培養(yǎng)未成熟樹突狀細胞（dendritic cells，DC），通過FCM、ELISA法檢測DC經IL—24轉染后表型和功能狀態(tài)的變化，研究IL—24促進DC成熟活化的作用。裸鼠成瘤實驗，觀察人胰腺癌patu8988細胞的成瘤情況及IL—24對裸鼠體內胰腺腫瘤的治療作用；通過免疫組化檢測腫瘤組織

6、中微血管密度MVD、VEGF、MMP—2的表達。 結果： 1．成功的從人外周血單個核細胞（PBMC）中提取并擴增出621bp的IL—24基因片段，經DNA測序證實該基因片段序列與Genbank中IL—24基因cDNA序列5’端轉錄起始位點附近621bp的基因序列完全一致。 2．成功地構建出攜帶IL—24基因片段的重組腺病毒Ad—IL—24，病毒滴度>5×1010pfu/ml。 3．Ad—IL—24感染的p

7、atu8988細胞增殖能力降低，凋亡率明顯升高。 4．IL—24刺激BMDCs48h后，細胞表現出成熟DCs的表型和功能特征，即共刺激分子CD40，CD80，CD86上調表達；并能有效拮抗負性調控因子IL—10下調DCs上CD40、CD80、CD86表達的作用，細胞培養(yǎng)液中IL—12、TNF—α的表達水平升高。 5．瘤內注射Ad—IL—24后胰腺腫瘤瘤體生長減慢，腫瘤內微血管密度MVD、VEGF、MMP—2較對照組明顯減