重組人Canstatin蛋白及溶瘤腺病毒He-Cans治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1. 隆人canstatin基因目的：克隆內(nèi)源性血管抑素canstatin基因，測(cè)定并分析其基因序列。方法：從人胎盤(pán)組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增canstatin基因，克隆進(jìn)載體pUCm-T，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T/canstatin，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)定基因序列。 結(jié)果：從人胎盤(pán)組織中提取出總RNA，10g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示3條清晰條帶，分別對(duì)應(yīng)28S，18S，

2、5S。分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260=0.879，A280=0.410，A260/A200=2.095，總RNA濃度為1.8g/L。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期的目的基因canstatin長(zhǎng)度一致。RT-PCR產(chǎn)物與載體pUCm-T連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在含氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)出藍(lán)色和白色菌落。挑選6個(gè)白色菌落做酶切鑒定，其中一個(gè)菌落經(jīng)BamHI和HindⅢ酶切后，證實(shí)為陽(yáng)性克隆。測(cè)定該陽(yáng)性克隆基因序列，結(jié)果顯示其

3、與GenBank公布的canstatin基因序列完全一致。結(jié)論：成功克隆了canstatin基因，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用打下基礎(chǔ)。 2. 核表達(dá)并純化重組人Canstatin蛋白目的：構(gòu)建canstatin原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化出重組人Canstatin蛋白。方法：利用BamHI和HindⅢ從重組質(zhì)粒pUCm-T/canstatin上切下canstatin基因，插入表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)相應(yīng)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化E.coliBL2

4、1。IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。超聲破碎菌體，Ni-NTA柱親和層析純化重組蛋白，PBS對(duì)其透析復(fù)性。 結(jié)論：成功構(gòu)建了canstatin原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化出重組人Canstatin蛋白，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用打下基礎(chǔ)。 3. 組人Canstatin蛋白治療胰腺癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的：驗(yàn)證重組人Canstatin蛋白體內(nèi)對(duì)胰腺癌的治療作用。方法：利用胰腺癌SW19~細(xì)胞株建立裸鼠

5、胰腺癌皮下和原位移植瘤模型。32只皮下移植瘤的裸鼠，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至2-3mm時(shí)，隨機(jī)分4組，即PBS(0.3ml1/日)對(duì)照組、5-Fu(25mg/kg，1/日×5天)治療組、Canstatin(5mg/kg，1/日×3周)治療組、及5-Fu(12.5mg/kg1/日×5天)+Canstatin(5mg/kg，1/日×3周)聯(lián)合治療組，給藥途徑為腹腔注射。24只原位移植瘤的裸鼠，手術(shù)后1周，隨機(jī)分為PBS(0.3ml，1/日)對(duì)照組、小劑量

6、Canstatin(5mg/kg，1/日)治療組和較大劑量Canstatin(10mg/kg，1/日)治療組，共3組，給藥途徑亦為腹腔注射，療程3周。治療期間，定期用圓規(guī)和游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤大小。療程結(jié)束時(shí)，取下瘤體，常規(guī)病理切片，CD34免疫組化染色，檢測(cè)腫瘤新生血管生成情況。結(jié)果：對(duì)裸鼠皮下移植瘤的治療結(jié)果表明，治療后第3天開(kāi)始，Canstatin治療組移植瘤體積顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)，到第10天時(shí)，有非常顯著差異(P＜

7、0.01)，療程結(jié)束時(shí)，抑瘤率為65.79％；聯(lián)合應(yīng)用5-Fu能增強(qiáng)療效，療程結(jié)束時(shí)，抑瘤率達(dá)82.20％；雖然5-Fu治療組療效最顯著，抑瘤率達(dá)94.74％，但藥物毒性反應(yīng)明顯，接受治療小鼠惡液質(zhì)明顯，病理證實(shí)有嚴(yán)重的肝損害。對(duì)裸鼠原位移植瘤的治療結(jié)果表明，小劑量和較大劑量Canstatin蛋白治療組，移植瘤體積和重量均顯著低于對(duì)照組，移植瘤體積分別為112.73±10.47mm3、61.75±6.99mm3、355.21±39.54

8、mm3。無(wú)論皮下還是原位移植瘤，接受Canstatin治療的腫瘤組織內(nèi)MVD均顯著低于對(duì)照組，而5-Fu單獨(dú)治療組，腫瘤內(nèi)MVD與對(duì)照組間無(wú)顯著差異。 結(jié)論：重組人Canstatin蛋白能有效抑制人胰腺癌生長(zhǎng)，抑瘤作用與劑量呈正相關(guān)，作用機(jī)制是抑制腫瘤新血管形成，沒(méi)有明顯副作用。與細(xì)胞毒藥物聯(lián)合使用，能增強(qiáng)抗腫瘤療效。 4. 帶canstatin基因的增殖型腺病毒載體He-Cans的構(gòu)建目的：將抗血管生成治療和基因治療相

9、結(jié)合，構(gòu)建攜帶canstatin基因的腫瘤特異性增殖型腺病毒He-Cans。 方法：利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增pET/canstatin載體上canstatin目的基因，EcoRI+BamHI酶切后，插入pCA13相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成pCA13-Cans；利用BglⅡ酶切位于pCA13-Cans上canstatin基因表達(dá)盒，插入穿梭載體pXC7C相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成pXC7C-Cans載體。pCA13-Cans和pXC7C-Cans分別與p

10、BGHE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，3次病毒空斑純化后，利用PCR技術(shù)對(duì)重組病毒進(jìn)行鑒定。最后，經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、氯化銫密度梯度離心純化后，TCID50檢測(cè)重組病毒滴度。 結(jié)論：獲得了高滴度重組非增殖腺病毒Ad5-Cans和增殖型腺病毒He-Cans，為研究其抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。 5. 殖型腺病毒He-Cans生物學(xué)特性體外實(shí)驗(yàn)研究目的：研究增殖型腺病毒He-Cans體外生物學(xué)特性。方法：通過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)重組腺

11、病毒He-Cans抗血管生成蛋白Canstatin表達(dá)情況，通過(guò)病毒增殖實(shí)驗(yàn)比較He-Cans在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中增殖差異，通過(guò)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)(MT實(shí)驗(yàn))，檢測(cè)He-Cans對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷能力。 結(jié)果：WesternBlot證實(shí)重組腺病毒Ad5-Cans及He-Cans感染胰腺癌BXPC-3細(xì)胞后能有效表達(dá)Canstatin蛋白；He-Cans在胰腺癌細(xì)胞株BXPC-3、PANC-1、AsPC-1中能有效增殖，而在人正常肝細(xì)

12、胞(LO2)中基本不增殖，在胰腺癌細(xì)胞中的增殖倍數(shù)是正常肝細(xì)胞的20倍以上。MTT結(jié)果顯示，增殖型病毒He-Cans對(duì)胰腺癌細(xì)胞有明顯的殺傷力，在MOI值為10時(shí)，致使3種胰腺癌細(xì)胞的死亡率均＞80％，而同樣MOI值，正常肝細(xì)胞死亡率僅24％。在MOI值為10時(shí)，Ad5-Cans處理的胰腺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異，均超過(guò)70％。 結(jié)論：Ad5-Cans和He-Cans在胰腺癌細(xì)胞中能有效的表達(dá)Canstatin抗血管生成

13、蛋白；其中He-Cans能特異性在腫瘤細(xì)胞(胰腺癌細(xì)胞)中增殖，并產(chǎn)生顯著的殺傷效應(yīng)，而在正常細(xì)胞中基本不增殖，殺傷力也弱。 6. 殖型腺病毒He-Cans治療人胰腺癌體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的：驗(yàn)證增殖型腺病毒He-Cans體內(nèi)抗腫瘤療效。 方法：以BXPC-3人胰腺癌細(xì)胞建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型。待腫瘤生長(zhǎng)至6-8mm，將30只荷瘤鼠隨機(jī)分為5組，即A組(PBS100μl)、B組(Canstatin蛋白5mg/kg)、C

14、組(Ad5-LacZ2×108pfu)、D組(Ad5-Cans2×108pfu)及E組(He-Cans2×108pfu)，給藥途徑為瘤內(nèi)注射，重組蛋白隔日注射1次，共注射10次，其余各組藥物隔日注射1次，共注射5次。定期用圓規(guī)和游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，療程結(jié)束時(shí)，取下瘤組織，CD34免疫組化染色，觀察腫瘤內(nèi)MVD變化。結(jié)果：療程結(jié)束時(shí)，A-E組腫瘤體積分別為2351.84±181.14mm3、1226.55±108.12mm3、2215.

15、93±149.77mm3、1452.79±226.20mm3、698.51±86.49mm3，B、D、E組腫瘤體積明顯小于A組和C組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，有非常顯著差異(P＜0.01)；而E組腫瘤體積顯著小于B組和D組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，亦有非常顯著差異(P＜0.01)。免疫組化結(jié)果表明，與A組相比較，B、D、E組腫瘤內(nèi)MVD明顯減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，D組有顯著性差異(P＜0.05)，B組和E組有非常顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：重組

16、增殖型腺病毒He-Cans能有效抑制胰腺癌生長(zhǎng)，療效強(qiáng)于Canstatin蛋白和非增殖腺病毒Ad5-Cans，具有給藥方便、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其臨床應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。 通過(guò)上述研究，本課題得出以下結(jié)論：1.成功克隆了人canstatin基因；2.成功構(gòu)建了canstatin原核表達(dá)載體；3.獲得了純化的重組人Canstatin蛋白，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能通過(guò)阻礙新生血管生成有效抑制人胰腺癌生長(zhǎng)，具有副作用少的突出優(yōu)點(diǎn)；

17、 4.成功構(gòu)建了攜帶canstatin基因的非增殖型腺病毒Ad5-Cans和增殖型腺病毒He-Cans； 5.非增殖型腺病毒Ad5-Cans能有效抑制裸鼠胰腺癌生長(zhǎng)，其作用是通過(guò)表達(dá)Canstatin蛋白抑制新生血管形成實(shí)現(xiàn)的。 6.增殖型腺病毒He-Cans能強(qiáng)力抑制裸鼠胰腺癌生長(zhǎng)，療效顯著強(qiáng)于Ad5-Cans和Canstatin蛋白，其作用機(jī)制是：一方面表達(dá)Canstatin蛋白從而抑制腫瘤新生血管形成，另一方面