重組人p53腺病毒注射液聯(lián)合放射治療對(duì)人淋巴瘤療效的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 采用重組人p53腺病毒注射液（recombinant adenovirus encoding human p53tumor suppressor gene，rAd—p53注射液，商品名今又生）聯(lián)合放射治療對(duì)淋巴瘤進(jìn)行體外和體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)，以探討該藥物對(duì)淋巴瘤的治療效果和是否具有輻射增敏性。 方法： 1.設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察Raji細(xì)胞和Daudi細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，并計(jì)算其熒光指數(shù)FI（f

2、luorescence index），檢測(cè)人淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi的膜表面柯薩奇腺病毒受體（Coxsackie—adenoviral receptor，CAR）和整合素受體（integrin receptors，avβ3、avβ5）的表達(dá)。 2.采用四氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）測(cè)定按比例稀釋成不同濃度的rAd—p53注射液在給藥后24、48和72h對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株R

3、aji和Daudi抑制率，以確定藥物的最佳劑量和最佳作用時(shí)間點(diǎn)。檢測(cè)不同照射劑量的放射治療以及其聯(lián)合最佳藥物劑量對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi抑制率，以確定一個(gè)固定的放射治療劑量。通過(guò)倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，來(lái)檢測(cè)rAd—p53注射液對(duì)細(xì)胞的抑制效果。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期變化以及細(xì)胞凋亡率，用RT—PCR檢測(cè)細(xì)胞的野生型p53基因mRNA的表達(dá)變化及其下游基因bcl—2和bax

4、的mRNA表達(dá)的改變，用蛋白質(zhì)的western免疫印跡法（western—blotting）觀察細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的變化等。通過(guò)不同指標(biāo)比較rAd—p53注射液、不同照射劑量的放射治療以及兩者聯(lián)合治療對(duì)Raji和Daudi人淋巴瘤細(xì)胞的作用效果。 3.建立人淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，其中荷Raji細(xì)胞裸鼠模型5只，荷Daudi細(xì)胞裸鼠模型4只，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)0.5cm時(shí)給予rAd—p53注射液

5、治療。初步觀察rAd—p53注射液的對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用和荷瘤鼠的生存期。 結(jié)果： 1.Raji細(xì)胞和Daudi細(xì)胞膜表面的CAR受體和avβ3受體的FI>1，受體為陽(yáng)性表達(dá)，而avβ5的受體為陰性表達(dá)，F(xiàn)I<1。 2.MTT檢測(cè)結(jié)果表明，人淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi的抑制率對(duì)rAd—p53注射液具有劑量和時(shí)間依賴性，，rAd—p53注射液劑量為2000vp/cell時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率趨于最大，最佳rAd—p

6、53注射液劑量為2000vp/cell，最佳時(shí)間點(diǎn)為48h，達(dá)到的最大抑制率分別為（27.5±4.1）%和（28.1±1.6）%；兩種細(xì)胞對(duì)放射治療也具有劑量依賴性，細(xì)胞抑制率隨劑量升高；聯(lián)合治療為2000vp/cell的rAd—p53注射液劑量和6Gy的照射劑量聯(lián)合。 3.在倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，rAd—p53注射液作用后的人淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi的細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化；放射

7、治療和聯(lián)合治療后，細(xì)胞形態(tài)較陰性對(duì)照組有明顯的差別，但放射治療加與不加rAd—p53注射液差別不明顯。 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明rAd—p53注射液對(duì)細(xì)胞周期未產(chǎn)生明顯的阻滯作用，也未見(jiàn)細(xì)胞凋亡率的增加；放射治療和聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯，Raji細(xì)胞阻滯于G2—M期，Daudi細(xì)胞阻滯于G0—G1期，細(xì)胞凋亡率明顯增高，分別為（35.6±1.7）%、（37.9±1.3）%和（31.1±2.4）

8、%、（31.5±2.0）%，但兩株細(xì)胞的放射治療和聯(lián)合治療的凋亡率比較未見(jiàn)明顯差異（P≥0.05）。 5. RT—PCR反應(yīng)結(jié)果顯示，rAd—p53注射液和放射治療、聯(lián)合治療均使野生型p53基因及bax基因的mRNA的表達(dá)均較陰性對(duì)照組有所增強(qiáng)；Raji細(xì)胞bcl—2基因的mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，Daudi細(xì)胞bcl—2基因?yàn)殛幮员磉_(dá)。Western—blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，rAd—p53注射液轉(zhuǎn)染和放射治療、聯(lián)合治療后

9、，人淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi的P53蛋白表達(dá)均有所增加。 6.荷人淋巴瘤裸鼠模型在給予藥物治療后，腫瘤體積依然隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，最終荷瘤模型均死于腫瘤引起的惡液質(zhì)。荷Raji細(xì)胞裸鼠模型最長(zhǎng)生存期為37d；荷Daudi細(xì)胞裸鼠模型最短生存期為22d。 結(jié)論： 1.Raji細(xì)胞和Daudi細(xì)胞膜表面的CAR受體和avβ3受體表達(dá)為陽(yáng)性，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腺病毒載體是可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入Raji細(xì)胞和Daudi細(xì)胞內(nèi)。

10、 2.rAd—p53注射液雖然對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Daudi可產(chǎn)生一定的抑制作用，并可使野生型p53基因表達(dá)增強(qiáng)，并激活其下游抑癌基因bax表達(dá)增強(qiáng)，而且外源性P53蛋白的表達(dá)也增加，但轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)的外源性p53基因的功能并沒(méi)有得到有效的發(fā)揮，因此未引起細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，也不能引起細(xì)胞周期的阻滯和細(xì)胞凋亡率的增加。說(shuō)明該藥物對(duì)Raji細(xì)胞和Daudi細(xì)胞具有一定的轉(zhuǎn)染性，并可引起細(xì)胞分子生物學(xué)水平的表達(dá)，但其抑