攜帶人mda-7-IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24靶向治療肝癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分?jǐn)y帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定
　　 目的：本文通過構(gòu)建攜帶人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24 載體，觀察其在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)，探討其對(duì)肝癌基因治療的理論價(jià)值。
　　 方法：酶切質(zhì)粒ZD55-IL24 得到IL24 連接到pClon9-INS-IL24，將pClon9-INS-IL24共酶切得到INS+IL24 片段，裝入

2、SG502-ΔCR2 載體中，獲得重組質(zhì)粒pSG600-IL24，以Polyfect 介導(dǎo)將其與腺病毒骨架質(zhì)粒ppE3 共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)同源重組，生成攜帶人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24，同樣的方法構(gòu)建空載體SG600-EGFP。將其感染人肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721和正常的肝細(xì)胞L02，RT-PCR驗(yàn)證mda-7/IL-24基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：可見感染后的HE

3、K293細(xì)胞出現(xiàn)特征性CPE，細(xì)胞變大、變圓、漂浮，呈葡萄串聚集。取克隆1和克隆2的病毒DNA各2μl 為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出約640bp的特異性片段，其大小與陽性對(duì)照相符，而陰性對(duì)照SG600-EGFP 則無片段擴(kuò)增。RT-PCR結(jié)果提示該載體能介導(dǎo)外源基因mda-7/IL-24在人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中高效表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24 載體，該載體能介導(dǎo)

4、mda-7/IL-24基因在人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中高效表達(dá)。
　　 第二部分溶瘤腺病毒SG600-IL24 選擇性殺傷肝癌細(xì)胞株的體外研究
　　 目的：觀察攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24 對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝細(xì)胞L02的選擇性抗腫瘤作用，為肝癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：將攜帶人mda-7/IL-

5、24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24 感染肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝細(xì)胞L02。通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、Western-blot 觀察MDA-7/IL-24基因的表達(dá)，四甲基偶氮哩藍(lán)染色法（MTT）觀察肝癌細(xì)胞的生長抑制，Hoechst33258染色觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，Annexin-Ⅴ和PI 雙染后流式細(xì)胞

6、儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，以及利用PI 單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)SG600-IL24 對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果：RT-PCR及Western-blot提示溶瘤腺病毒SG600-IL24能介導(dǎo)外源基因MDA-7/IL-24在肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝細(xì)胞L02中高效表達(dá)，ELISA檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA-7/IL-24蛋白也明顯增加，MTT結(jié)果表明SG600-I

7、L24能明顯抑制各種肝癌細(xì)胞的生長，Hoechst33258 染色提示SG600-IL24促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞儀提示SG600-IL24能選擇性殺傷肝癌細(xì)胞，細(xì)胞周期分析提示MDA-7/IL-24阻滯肝癌細(xì)胞在G2/M期，而對(duì)正常的肝細(xì)胞沒有明顯的促凋亡作用和增殖阻滯作用。
　　 結(jié)論：攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24 能特異性殺傷不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖阻滯，而

8、對(duì)正常肝細(xì)胞無明顯的促進(jìn)凋亡和增殖阻滯作用。
　　 第三部分溶瘤腺病毒SG600-IL24 選擇性殺傷肝癌細(xì)胞的機(jī)理探討
　　 目的：探討攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24 對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3的殺傷機(jī)制，為肝癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：用溶瘤腺病毒SG600-IL24 干預(yù)肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞株L02。通過RT-PCR和West

9、ern-blot 蛋白印跡檢測(cè)SG600-IL24 干預(yù)后，肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞株L02 內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)總STAT3以及信號(hào)通路下游信號(hào)分子C-myc、bax、bcl-2、bcl-xl、CyclinD2、Survivin、XIAP、OPN、MMP-2、MMP-9和VEGF基因和蛋白的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)各細(xì)胞株在溶瘤腺病毒SG600-IL24 處理后，磷酸化STAT3 蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：RT-P

10、CR和Western-blot結(jié)果提示STAT3以及信號(hào)通路下游信號(hào)分子C-myc、Bcl-xl、bcl-2、CyclinD2、Survivin、MMP-2、MMP-9、XIAP、OPN、VEGF基因和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而Bax基因和蛋白表達(dá)水平在溶瘤腺病毒SG600-IL24感染后上調(diào)。而磷酸化STAT3蛋白在感染后先上升后下降，在感染2小時(shí)達(dá)到峰值。
　　 .結(jié)論：溶瘤腺病毒SG600-IL24可能通過抑制STAT3及下游的

11、信號(hào)通路來達(dá)到抗肝癌的作用，而正常肝細(xì)胞幾乎不受此影響，使得溶瘤腺病毒SG600-IL24具有顯著的選擇性抗腫瘤效應(yīng)。
　　 第四部分溶瘤腺病毒SG600-IL24和干擾素聯(lián)合治療裸鼠肝癌的研究
　　 目的：利用攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24與干擾素(IFN)聯(lián)合治療肝癌裸鼠移植瘤，探討病毒基因治療和新輔助治療相結(jié)合治療肝癌的新方法。
　　 方法：首先建立裸鼠皮下種植肝癌模型，當(dāng)

12、腫瘤體積生長至100-150 mm3，計(jì)為第0天，并將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組8只：(1)對(duì)照組：正常荷瘤裸鼠，每只裸鼠給予生理鹽水0．3 ml，右側(cè)腹腔內(nèi)注射，每天一次，共3 次。(2)新輔助治療組(IFN組)：IFN1.5x104 IU/g/只，注射于右側(cè)腹腔，每天一次，共10 次。(3)基因治療組(SG600-IL24組)：給予溶瘤腺病毒(SG600-IL24)治療，腫瘤局部多點(diǎn)注射，每只2 x 108 PFU/次，共5次，隔日一次

13、。(4)基因治療+新輔助治療組(SG600-IL24+IFN組)：IFN的用法同前，SG600-IL24在IFN治療結(jié)束后一天進(jìn)行，SG600-IL24的用法同基因治療組。并在干預(yù)30d后檢測(cè)腫瘤組織中mda-7/IL-24基因和蛋白的表達(dá)，隨后觀察各組裸鼠生存時(shí)間及腫瘤體積的變化。
　　 結(jié)果：溶瘤腺病毒SG600-IL24 介導(dǎo)的外源基因MDA-7/IL-24在基因治療組和聯(lián)合治療組裸鼠體內(nèi)表達(dá)明顯增高，SG600-IL24