PAMAM納米轉運體系在體內(nèi)外基因轉運及白血病基因治療中的應用.pdf

1、對疾病的預防和治療來講，基因治療是一種有效和經(jīng)濟的方法。高效的基因轉移和表達是基因治療的關鍵技術。目前常用的基因載體包括病毒載體和非病毒載體，且臨床試驗中75％以上利用病毒為載體來轉運目的基因。雖然病毒載體具有較高的轉染效率，但同時也存在著很多難以克服的缺點，如具有免疫原性、細胞毒性、缺少組織特異性等等。因此對非病毒載體的研究受到人們的重視，而目前常用的非病毒載體，如多聚陽離子聚合物和脂質體，也存在著轉染效率低，尤其在體內(nèi)的轉染效率低等

2、缺點。因此尋找新的高效、安全、靶向的非病毒載體成為目前的研究熱點。 隨著納米技術的興起和發(fā)展，在納米尺度內(nèi)的物質的納米特性引起了人們的關注。納米顆粒一般是指尺寸在1～100 nm間的粒子，表現(xiàn)出強烈的尺寸依賴性、表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等特點，從而使其出現(xiàn)了許多不同于常規(guī)固體的新奇特性。由于納米粒子表面原子數(shù)增多，表面原子配位數(shù)不足和高的表面能，使這些原子易與其它原子相結合而穩(wěn)定下來，故方便在納米顆粒的表面結合生物

3、大分子，成為生物分子的高效載體。同時納米顆粒的小粒徑效應，使得它們可以有效的逃避脾濾過、延長血液循環(huán)時間、增強靶組織的累積，從而得以實現(xiàn)有效的基因轉移。由于納米顆粒作為基因轉移載體具有如此眾多的優(yōu)越性，使其成為突破基因轉移瓶頸最有希望的工具，是當今基因轉移和納米生物研究領域最熱門的課題之一。目前研究較多的陽離子聚合物中發(fā)展最快的是樹枝狀聚合物(dendrimers)，其中又以聚酰胺一胺型樹枝狀聚合物(PAMAM dendrimers)研

4、究的最為廣泛。PAMAM作為基因載體具有很多優(yōu)勢，不會引起機體的免疫反應、無遺傳毒性和細胞毒性、不會導致細胞的轉化和細胞死亡、具有很高的基因轉移效率、能介導外源基因在宿主細胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉基因的長期、穩(wěn)定表達，還可以保護轉移基因不受機體血漿或組織細胞中各種補體以及各種酶的破壞，從而有利于目的基因在轉移進入靶細胞后能更好、更穩(wěn)定的發(fā)揮作用。因此PAMAM作為基因載體具有廣闊的應用前景。 【PAMAM納米載體結合和

5、保護DNA的能力】 本研究項目通過體內(nèi)外實驗驗證了PAMAM dendrimers作為基因載體的可行性，并將其應用于白血病的基因治療研究。首先制備水溶性的PAMAM dendrimers納米顆粒，原子力顯微鏡檢測顯示PAMAM直徑約8 nm±0.5 nm左右，分布均勻。作為基因載體，與DNA的結合能力是必備條件之一，應用凝膠阻滯實驗和DNA共沉淀實驗來評價PAMAM的DNA結合能力。結果顯示，該納米顆粒在pH 5～9時可以結合和

6、保護DNA，但是在pH 3時就喪失了這種能力。因此PAMAM具有在生理條件下(pH 7.35～7.45)對DNA的結合和保護能力。Zeta電位測定說明PAMAM的DNA結合能力是基于一種電負性DNA磷酸骨架和PAMAM的正電性之間的靜電結合。用MTT檢測PAMAM、PAMAM/DNA復合物對不同細胞系COS7、SMF、K562和Jurkat細胞生長的影響，結果顯示在質量比為2：1～4：1時形成的PAMAM/DNA復合物對細胞生長的影響很

7、小，但質量比超過4：1時形成的復合物對細胞的生長有一定的影響。 【PAMAM基因轉運體系的體內(nèi)外研究】 以PAMAM為載體轉染編碼綠色熒光蛋白的報道基因pEGFP-C2到COS7細胞，直接在熒光顯微鏡下觀察其轉染效率，結果證實PAMAM可以有效的攜帶外源基因在細胞中分布并表達出目的蛋白。但是，熒光素酶分析結果顯示PAMAM與目的DNA以不同比例結合時的轉染效率不同，當PAMAM/DNA質量比為4：1時，轉染效率達到最高。

8、掃描電子顯微鏡下直觀觀察細胞對PAMAM/DNA復合物的吞噬，結果顯示細胞可以高效吞噬PAMAM及其復合體，并在細胞的胞漿和胞核中廣泛分布，但在胞漿中的分布比胞核中要多。 為觀察攜帶外源質粒DNA的PAMAM在體內(nèi)的分布狀況，將PAMAM/EGFP-C2復合物從BALB/c小鼠尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，在不同時間點處死小鼠，取其各組織器官用戊二醛固定，制備組織切片在掃描電子顯微鏡下觀察PAMAM和PAMAM/DNA在體內(nèi)的組織細胞

9、分布。同時制備冰凍切片，直接在熒光顯微鏡下觀察PAMAM攜帶DNA在體內(nèi)的組織分布及表達。電鏡檢測顯示，小鼠的肝、腎、肺、脾、胰、腦、淋巴結和骨髓中有較多的PAMAM及PAMAM/DNA復合物存在，而在腸、胃、心中分布較少或沒有分布。 PAMAM可以在小鼠的腎小管中分布，說明PAMAM可以通過腎臟排泄，不會在體內(nèi)蓄積。在小鼠的淋巴結和骨髓中也有。PAMAM的分布，說明PAMAM可以有效的到達造血器官。組織熒光檢測結果顯示，PAM

10、AM/DNA復合物在小鼠的肝、腎、肺、脾中有很強的熒光表達，而在心、腦、胃、腸中未檢測到明顯的熒光信號。 【PAMAM基因轉運體系對白血病基因治療的研究】 PAMAM載體具備結合和保護DNA的能力、較高的轉染效率、攜帶外源基因在體內(nèi)組織的廣泛分布和表達，為其作為基因載體進行基因治療研究提供了實驗基礎。在腫瘤病理標本的獲取、對治療有直接意義的造血干/祖細胞的體外分離純化、擴增以及骨髓移植等方面，白血病都有其在基因治療領域中

11、的獨特優(yōu)勢，因而受到廣大學者的重視，以期以白血病的基因治療為突破口，開辟人類腫瘤治療的新天地。p16基因是一個經(jīng)典的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)p16基因缺失在多種腫瘤的細胞株中存在，占已知腫瘤細胞株的30～50％，在白血病細胞株中占25～64％，說明p16基因異常與多種腫瘤有密切關系。LRRC4基因是我室克隆的基因，實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)LRRC4可能作為一個受體或受體激酶或粘附分子參與調控細胞因子或生長因子所介導的信號傳導通路，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育

12、和腫瘤的形成。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)p16和LRRC4基因在K562細胞中的表達明顯下調。為了明確其在體內(nèi)對于引發(fā)慢性粒細胞性白血病的K562細胞是否具有治療效果，構建了K562-SCID白血病模型，評價p16和LRRC4對于白血病基因治療的效果，并為PAMAM作為基因載體用于體內(nèi)實驗提供了更加充分的實驗依據(jù)。對SCID小鼠經(jīng)尾靜脈注射K562細胞的方式建立人慢性粒細胞性白血病細胞異體移植SCID小鼠白血病動物模型，以PAMAM為載體，攜

13、帶目的治療基因p16和LRRC4通過靜脈注射治療。結果表明PAMAM同時攜帶p16和LRRC4基因時能對白血病進行有效的治療，降低外周血中原始粒細胞的比例；減輕白血病對肝、脾和骨髓的浸潤轉移；使白血病小鼠的存活率延長43％，其治療效果明顯。這些結果說明，PAMAM可以攜帶目的基因到達骨髓、肝臟、脾臟以及其他組織器官，并表達出相應的蛋白而發(fā)揮作用。LRRC4和p16基因的共同作用可以有效的抑制K562細胞在體內(nèi)的增殖，從而減緩其誘導的慢性

14、粒細胞性白血病的發(fā)生和發(fā)展。 綜上所述，PAMAM具有基因載體的必要條件，包括在生理條件下結合和保護DNA；能在體內(nèi)外被細胞吞噬，并在細胞的胞漿和胞核分布。結合報道基因系統(tǒng)證實了PAMAM可以將外源基因攜帶至肝、腎、肺、脾，并且在上述組織中表達出目的蛋白。本研究結合納米技術和分子生物學技術，創(chuàng)新性的應用PAMAM作為載體，評價了其攜帶p16和LRRC4抑癌基因對白血病動物模型的治療效果，充分利用了納米顆粒的優(yōu)勢，為血液系統(tǒng)疾病的