Rep-RBE定點(diǎn)整合系統(tǒng)介導(dǎo)的B型血友病基因治療的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:以B型血友病為基研究對象，構(gòu)建含有肝特異性元件的表達(dá)載體，利用先前我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自腺相關(guān)病毒的、具有單一位點(diǎn)整合功能的RBE-Rep核心元件建立的位點(diǎn)特異性整合轉(zhuǎn)基因體系、檢測攜帶hFIX的載體在轉(zhuǎn)基因動物模型體內(nèi)的動力學(xué)特征及整合情況，并對其毒性進(jìn)行評估。
　　方法:構(gòu)建RBE-HCR-hAAT-hFIX質(zhì)粒，評估其在不同細(xì)胞的表達(dá)情況，并與之前構(gòu)建的RBE-CMV-hFIX質(zhì)粒進(jìn)行比較;RBE-HCR-hAAT-hFIX

2、質(zhì)粒與Rep表達(dá)質(zhì)粒通過高壓尾靜脈注射的方式共同給予轉(zhuǎn)人類AAVS1位點(diǎn)的小鼠，。ELISA檢測hFIX蛋白表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，PCR和RT-PCR評估質(zhì)粒在體內(nèi)的分別和轉(zhuǎn)錄，100天后進(jìn)行大部分肝切除手術(shù)，nested-PCR檢測其整合情況，RBE-CMV-hFIX質(zhì)粒作為對照;檢測系統(tǒng)安全性，測定注射后不同時(shí)間點(diǎn)肝損傷及谷丙轉(zhuǎn)氨酶變化情況。
　　結(jié)果:RBE-HCR-hAAT-hFIX質(zhì)粒在體內(nèi)的hFIX蛋白表達(dá)RBE

3、-CMV-hFIX質(zhì)粒相比在注射開始并無顯著差異，但在注射120天后，RBE-HCR-hAAT-hFIX質(zhì)粒的hFIX蛋白表達(dá)幾乎是RBE-CMV-hFIX的4倍，且在以后的實(shí)驗(yàn)中持續(xù)明顯高于RBE-CMV-hFIX質(zhì)粒。RBE-HCR-hAAT-hFIX質(zhì)粒整合效率不低于RBE-CMV-hFIX質(zhì)粒組。高壓尾靜脈注射后，會對動物肝臟有急性的但是瞬時(shí)的損傷且由于這種操作引起而非質(zhì)粒本身。
　　結(jié)論:將裸質(zhì)粒作為載體，利用RBE-R