弱后酸化保加利亞乳桿菌的應(yīng)激性及其遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，在食品工業(yè)和醫(yī)療保健等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。但其自然菌株往往不具備工業(yè)生產(chǎn)所需要的各種優(yōu)良性狀或者性狀不顯著。因此需要使用定向培育、誘變育種和細(xì)胞融合等育種方法來選育性狀優(yōu)良的菌株。用于制造酸奶的德氏乳桿菌保加利亞亞種是導(dǎo)致酸奶后酸化的主要誘因，酸奶的后酸化會(huì)導(dǎo)致酸奶出現(xiàn)消費(fèi)者不可接受的過酸味及感官質(zhì)量下降，影響酸奶的長(zhǎng)期貯存，因此利用誘變育種來篩選弱后酸化德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵劑菌

2、株并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)對(duì)直投式酸奶發(fā)酵劑的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。
　　 本課題包括以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)：H+-ATPase缺陷突變菌株的誘變、酸應(yīng)激及冷應(yīng)激對(duì)親本和突變菌株生長(zhǎng)及質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響、突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、H+-ATPase缺陷突變菌株的代謝動(dòng)力學(xué)、親本和突變菌株H+-ATPase表達(dá)的比較、弱后酸化酸奶的研制。
　　 首先利用新霉素作為誘變壓力，從本實(shí)驗(yàn)室選育的一株可用于制作酸奶發(fā)酵劑的德氏乳

3、桿菌保加利亞亞種KLDS1，9201篩選得到一株H+-ATPase缺陷的自發(fā)突變菌株，命名為KLDS1.9201-11。對(duì)KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的生長(zhǎng)情況和pH值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)KLDS1.9201-11的生長(zhǎng)速率明顯比KLDS1.9201的低，而且在生長(zhǎng)過程中其pH值明顯高于KLDS1.9201，即產(chǎn)酸能力較弱。
　　 使用天根DP430細(xì)菌RNA提取試劑盒提取KLDS1.9201和KLDS1.9201

4、-11對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的總RNA，經(jīng)DNasel(RNase-free)處理后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)來測(cè)定KLDS1.9201和KLDS1.9201-11對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期中質(zhì)膜H+-ATPase的表達(dá)，結(jié)果表明，各菌株的H+-ATPase酶的表達(dá)量差異顯著(p<0.05)，其中，對(duì)數(shù)期的KLDS1.9201-11(突變菌株)的H+-ATPase酶的表達(dá)量約是KLDS1.9201(親本菌株)的24％，穩(wěn)定期的KLDS

5、1.9201-11(突變菌株)的H+-ATPase酶的表達(dá)量約是KLDS1.9201(親本菌株)的33%。
　　 對(duì)KLDS1.9201和KLDS1.9201-11進(jìn)行酸應(yīng)激和冷應(yīng)激，在酸應(yīng)激后，KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的存活率明顯下降，活菌數(shù)分別減少了86.98%和99.98%，H+-ATPase活性分別降低了13.33%和21.15%，KLDS1.9201-11表現(xiàn)出了更強(qiáng)的酸敏感性。在冷應(yīng)激后，KL

6、DS1.9201和KLDS1.9201-11的活菌數(shù)分別下降了76.71%和4.88%，親本菌株的H+-ATPase活性降低了4.27%，突變菌株的H+-ATPase活性上升了29.71%，這說明突變菌株的冷適應(yīng)性比親本菌株要好，這有利于直投式發(fā)酵劑的制作過程中活菌數(shù)的提高。
　　 使用天根公司的DNA提取試劑盒提取KLDS1.9201-11第一代至第八代的基因組DNA，并利用篩選出的5種引物對(duì)提取出的基因組DNA進(jìn)行RAPD分

7、析。利用5種引物進(jìn)行的突變菌株的RAPD分析產(chǎn)生的DNA指紋圖譜結(jié)果表明，在連續(xù)傳代8次后，突變菌株KLDS1.9201-11的基因組DNA指紋圖譜基本沒有變化，隨機(jī)擴(kuò)增條帶數(shù)相同且亮度接近，說明其基因組DNA具有高度的同源性，并沒有隨著菌株弱后酸化能力的丟失而發(fā)生變化。
　　 通過高效液相色譜的方法對(duì)KLDS1.9201和KLDS1.9201-11的第一代到第十代的菌液中代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，代謝產(chǎn)物包括葡萄糖和乳酸。結(jié)果表明，K

8、LDS1.9201的葡萄糖代謝率始終比KLDS1.9201-11高，乳酸產(chǎn)量也高。且KLDS1.9201-11能夠穩(wěn)定遺傳至第八代，到九代開始回復(fù)突變。
　　 選用嗜熱鏈球菌KLD3.9210分別與KLDS1.9201和KLDS1.9201-11進(jìn)行混合培養(yǎng)制作酸奶。感官評(píng)定結(jié)果表明，無論在滋味/氣味、組織狀態(tài)和色澤等方面這兩種酸奶都沒有明顯的差異。貯存試驗(yàn)結(jié)果表明，在4℃下保存21天后，使用KLDS1.9201-11制備的酸奶