利用轉錄組學技術對保加利亞乳桿菌ATCC11842后酸化分子機制的研究.pdf

1、酸奶是含有活菌的乳制品，在正常的發(fā)酵結束后，菌體仍會利用其中的營養(yǎng)物質進行新陳代謝，同時會繼續(xù)產酸，即發(fā)生后酸化。后酸化導致酸奶的口感下降、貨架期縮短，嚴重影響乳制品行業(yè)的發(fā)展。研究表明，保加利亞亞種是導致酸奶后酸化的直接原因，在酸奶發(fā)酵后期控制保加利亞乳桿菌的生長代謝是解決后酸化的關鍵。近年來，國內外學者展開了對后酸化機理的研究并取得了一定的成果，但研究主要集中在H+-ATP酶和β-半乳糖苷酶，而關于后酸化調控模型的研究未見報道。后酸

2、化導致菌體生長處于酸和冷脅迫，因此本研究采用轉錄組學技術結合熒光定量PCR技術對模式菌株保加利亞乳桿菌ATCC11842菌株在酸脅迫和冷脅迫的過程中參與后酸化的關鍵基因進行分離鑒定，為全面揭示乳酸菌的酸耐受機制奠定理論基礎，同時為工業(yè)生產中解決酸奶后酸化問題提供理論依據(jù)。
　　研究內容及結果如下:
　　(1)不同處理下保加利亞乳桿菌ATCC11842轉錄組測序及測序質量評估
　　對保加利亞乳桿菌(ATCC11842)進

3、行酸脅迫及酸和冷的脅迫處理，樣品分別命名為T1和T2，對照未脅迫處理樣品命名為CK。分別提取各樣品RNA，逆轉錄，構建測序文庫。利用Illumina HiSeq2000測序平臺進行轉錄組測序。轉錄組測序得到的原始數(shù)據(jù)(reads)信息已經提交到NCBI的SAR數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra_sub/sub.cgi)，CK（編號為:SRR3490433），T1(編號為:SRR34907

4、16)，T2(編號為:SRR3501037)。
　　(2)保加利亞乳桿菌脅迫過程qPCR內參基因的篩選及轉錄組測序結果的驗證
　　通過對保加利亞乳桿菌ATCC11842在空白處理(CK)、酸脅迫(T1)、酸和冷脅迫(T2)三種試驗條件下的5個候選內參基因(16s-rDNA、rpoB、ldh、rodA和recA)的表達穩(wěn)定性進行了研究，通過三種常用的程序geNorm、NormFinder和Bestkeeper篩選出合適的內參基

5、因用于后續(xù)試驗熒光定量PCR數(shù)據(jù)的校正，最終確定rpoB基因和recA基因為本試驗理想的內參基因，并用篩選得到的內參基因對隨機選取的9個基因的轉錄組測序結果進行了qRT-PCR驗證，結果顯示9個基因的表達量變化趨勢與測序結果一致，表明了轉錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性及選取的內參基因的穩(wěn)定性。
　　(3)保加利亞乳桿菌ATCC11842后酸化相關基因的轉錄水平的分析
　　經過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在樣品CK共有1503個基因參與表達，T

6、1中共有1506個基因參與表達。通過比較CK與T1之間表達譜的差異發(fā)現(xiàn)所有參與酸脅迫過程的基因。經過差異分析，269個基因在酸脅迫（樣品T1）過程中上調，143個基因酸脅迫后下調，表明412個基因與酸脅迫過程有關。轉錄組測序結果顯示，T2中共有1504個基因參與表達過程，與空白處理(CK)轉錄組數(shù)據(jù)對比，在T2樣品中存在69個上調基因和33個下調基因。同時我們對412個酸響應基因在冷脅迫下的基因表達量變化進行了統(tǒng)計分析，參照轉錄組測序結

7、果，酸響應基因在冷脅迫下主要有以下幾種變化趨勢:
　　a.冷脅迫處理后酸響應基因的變化趨勢與酸脅迫處理下基本一致。
　　b.冷脅迫處理后酸響應基因變?yōu)榉遣町惢颉?br>　　c.冷脅迫處理后酸響應基因表達量下調。
　　統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，269個上調表達的酸響應基因，冷脅迫處理后，57個基因的表達量變化趨勢基本一致，說明冷脅迫并未影響這些酸響應基因的表達;207個上調酸響應基因在經過冷脅迫后，表達量差異不顯著，說明冷脅迫使這

8、些基因退出酸響應過程;而其中的5個基因在冷脅迫后，表達量顯著下調，表明冷脅迫嚴重抑制了這些酸響應基因的表達。同樣，酸脅迫下表達量下調的143個基因中，冷脅迫處理后，17個基因的表達量變化趨勢基本一致，說明冷脅迫并未影響這些酸響應基因的表達，126個下調酸響應基因在經過冷脅迫后，表達量差異不顯著，說明冷脅迫使這些基因退出酸響應過程。進一步我們認為上調表達的57個和下調表達的17個酸響應基因在受冷脅迫處理后仍然參與酸響應過程，正如酸奶發(fā)酵結