保加利亞乳桿菌CcpA基因的敲除及其抗脅迫能力的研究.pdf

1、在乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)過程中，乳酸菌會(huì)遇到冷凍、干燥和高滲等不利條件的影響，造成乳酸菌細(xì)胞膜損傷和破壞、細(xì)胞衰亡、失去活性、導(dǎo)致發(fā)酵劑產(chǎn)品質(zhì)量降低，這些不利條件對(duì)乳酸菌的脅迫已經(jīng)成為制約其工業(yè)化的瓶頸。乳酸菌在變化的環(huán)境中能通過改變自身代謝增強(qiáng)對(duì)外界環(huán)境的抵抗力。研究發(fā)現(xiàn)，碳分解代謝阻遏蛋白CcpA能夠調(diào)控諸多應(yīng)激反應(yīng)蛋白，是微生物抗脅迫的重要調(diào)控因子。因此，本研究重點(diǎn)分析CcpA缺失對(duì)保加利亞乳桿菌的影響，通過對(duì)比野生菌和突變菌在生長代

2、謝、關(guān)鍵酶活以及抗脅迫方面的變化，探討CcpA與菌株抗脅迫的關(guān)系，為下一步抗脅迫機(jī)理的研究做鋪墊。
　　本研究以德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）ATCC11842為研究對(duì)象。利用同源重組的方法獲得CcpA突變菌株，分別從生長代謝、關(guān)鍵酶活和抗逆性進(jìn)行對(duì)比分析。通過高效液相色譜法分析葡萄糖和有機(jī)酸代謝情況，通過分光光度法和比色法分析關(guān)鍵酶活性變化情況。

3、r>　　研究結(jié)果顯示:CcpA基因缺失后，德式乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842的生長受到抑制。與原始菌株（野生菌）相比，在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，CcpA突變菌進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間比野生菌遲緩4h左右，均步入穩(wěn)定期后，CcpA突變菌的菌體密度比野生菌低23.08％。
　　CcpA缺失對(duì)葡萄糖消耗速率有一定的影響。有氧培養(yǎng)時(shí)，野生菌的葡萄糖消耗速率比突變菌高15.30％（P＜0.05），無氧培養(yǎng)時(shí)則高7.98％(P＜0.05);對(duì)同一菌株

4、而言，有氧培養(yǎng)時(shí)對(duì)葡萄糖的消耗均大于無氧培養(yǎng)，其中野生菌為5.47％（P＜0.05），突變菌為12.62％（P＜0.05）。另外，CcpA缺失對(duì)乳酸和乙酸的生成速率也有一定的影響。有氧培養(yǎng)時(shí)，野生菌的乳酸生成速率比突變菌高47.62％(P＜0.05)，無氧培養(yǎng)時(shí)野生菌的乳酸生成速率比突變菌高21.87％（P＜0.05）;對(duì)同一菌株而言，無氧培養(yǎng)時(shí)乳酸生成速率均大于有氧培養(yǎng)，其中野生菌為23.94％(P＜0.05)，突變菌為50.13％(

5、P＜0.05)。對(duì)乙酸而言，有氧培養(yǎng)時(shí)，突變菌的乙酸生成速率比野生菌高47.73％(P＜0.05)，無氧培養(yǎng)時(shí)兩者差異不顯著。
　　通過對(duì)比分析野生菌和突變菌的糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的變化得出，在有氧條件下，CcpA突變菌的胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活力比野生菌的胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活力降低了72.22％(P＜0.05)，磷酸果糖激酶活力降低了60.07％(P＜0.05)，丙酮酸激酶活力降低了70.58％（P＜0.05）;無氧條件下，其胞內(nèi)乳酸脫

6、氫酶活力降低了36.75％(P＜0.05)，磷酸果糖激酶活力降低了62.87％（P＜0.05），丙酮酸激酶活力降低了29.05％（P＜0.05）。無論是有氧培養(yǎng)還是無氧培養(yǎng)，CcpA缺失后乳酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性均顯著降低，說明CcpA蛋白參與這三種酶的激活調(diào)控，當(dāng)CcpA缺失后，三種酶的活性下降。
　　CcpA缺失后，菌體的耐熱性下降，菌體密度只有原對(duì)照組的3.14％（P＜0.05）。在不同培養(yǎng)條件下CcpA突

7、變菌對(duì)冷的耐受性不同。有氧培養(yǎng)時(shí)，0～12d內(nèi)突變菌的菌體密度是野生菌的48.42％;無氧培養(yǎng)時(shí)，突變菌的菌體密度只有野生菌的8.16％。對(duì)同一菌株而言，有氧培養(yǎng)時(shí)菌體耐冷性均比無氧培養(yǎng)時(shí)高，其中野生菌高出7.93％(P＜0.05)，突變菌則高出91.52％(P＜0.05)。
　　研究結(jié)果表明:利用同源重組的方法分別構(gòu)建CcpA敲除載體pCT和打靶片段，將敲除載體pCT和打靶片段電轉(zhuǎn)化至德式乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842中，

8、成功獲得CcpA基因缺失的突變菌。實(shí)驗(yàn)表明，CcpA突變菌的乳酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性下降顯著，糖酵解途徑關(guān)鍵酶活的下降直接導(dǎo)致糖酵解途徑減弱，進(jìn)而出現(xiàn)葡萄糖利用率降低和生長速率下降的現(xiàn)象，由此推斷，CcpA蛋白是糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控的總因子;對(duì)野生菌而言，有氧培養(yǎng)和無氧培養(yǎng)時(shí)的酶活差異顯著;而突變菌酶活性差異不顯著，推斷CcpA參與了菌體呼吸鏈的調(diào)控。CcpA突變菌的耐熱性和耐冷性顯著下降，抗氧化損傷能力顯著提高，推斷Ccp