重離子輻照并篩選截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株的研究.pdf

1、截短側(cè)耳素是由斜蓋菇屬真菌Clitopilus pinsitus深層發(fā)酵產(chǎn)生的抗生素，可以與細(xì)菌核糖體50S亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成。其衍生物類抗生素泰妙菌素、沃尼妙林對(duì)葡萄球菌、鏈球菌和克雷帕氏菌具有很好的抑菌作用，可用于治療豬痢疾和地方性肺炎等豬疾病，而且具有生物利用率高、毒性低和殘留少的優(yōu)勢(shì)。目前，存在的主要問題是截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌株效價(jià)低，發(fā)酵周期長(zhǎng)，發(fā)酵技術(shù)不成熟，因此，本研究以截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌株為材料，優(yōu)化原生質(zhì)體制備條

2、件，篩選通過重離子輻照的再生菌株，以期選育出截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌高產(chǎn)菌株。
　　本論文首先采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)對(duì)斜蓋菇屬真菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理,實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究了菌齡、破壁酶種類和濃度、穩(wěn)滲劑種類和濃度、酶解時(shí)間和溫度等條件對(duì)截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus pinsitus原生質(zhì)體的得率和再生率的影響；并優(yōu)化了原生質(zhì)體制備條件。最終確定其最佳制備及再生條件為：5d菌齡，1.5％蝸牛酶+1.5%纖維素酶復(fù)合酶，0

3、.4mol/L甘露醇，25℃酶解1.5h。該條件下原生質(zhì)體制備量為5.9╳107個(gè)/mL，其再生率為1.20‰。
　　然后，實(shí)驗(yàn)選用不同吸收劑量的12C6+離子束輻照斜蓋菇屬真菌原生質(zhì)體，以期選育出截短側(cè)耳素高產(chǎn)變異株。結(jié)果顯示：12C6+離子束吸收劑量為1.5 Gy的條件下，斜蓋菇屬真菌原生質(zhì)體變異率為43.62%。
　　隨后，實(shí)驗(yàn)利用金色葡萄球菌對(duì)截短側(cè)耳素有較高敏感性的特點(diǎn)建立了一種瓊脂柱高通量篩選法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：截

4、短側(cè)耳素的產(chǎn)量與抑菌圈直徑為顯著正相關(guān)，其皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.956（P<0.01），即通過觀察抑菌圈直徑的大小，可以初步篩選出截短側(cè)耳素產(chǎn)量較高的菌株。最終選育出C.pin15I5E和C.pin15II6B兩株正變異株，其產(chǎn)量較出發(fā)菌株分別提高16.17%和15.47%。
　　最后，實(shí)驗(yàn)采用Logistics方程和Luedeking-Piret方程建立截短側(cè)耳素高產(chǎn)突變株發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和底物消耗的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，更好地