MPLA輻射防護(hù)作用及ACSL6敲除放射增敏研究.pdf

1、背景:
　　隨著電離輻射的日益廣泛應(yīng)用，開(kāi)發(fā)低毒高效的輻射防護(hù)劑迫在眉睫。近年來(lái)，NF-κB逐漸成為輻射防護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，對(duì)其激活可誘發(fā)細(xì)胞多種促存活事件，對(duì)正常組織產(chǎn)生輻射防護(hù)作用。然而，激活NF-κB還可引發(fā)炎癥因子爆發(fā)、腫瘤細(xì)胞能量代謝改變等諸多反應(yīng)。因此，如何駕馭NF-κB使其發(fā)揮對(duì)正常組織的輻射防護(hù)作用，避免其副作用，增強(qiáng)腫瘤放療效果，引起了我們的研究興趣。研究表明，通過(guò)TLRs受體激活NF-κB可以很好地實(shí)現(xiàn)這一目的

2、。因此，本課題第一部分圍繞新型TLR4激動(dòng)劑MPLA對(duì)小鼠多器官輻射損傷防護(hù)效應(yīng)及機(jī)制展開(kāi)了研究。此外，還針對(duì)MPLA對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響進(jìn)行了檢驗(yàn)。在第二部分中，則主要圍繞IR對(duì)癌細(xì)胞NF-κB相關(guān)代謝關(guān)鍵酶ACSL家族的影響、Acsl6在調(diào)節(jié)腫瘤放療敏感性方面的重要作用及其分子機(jī)制、MPLA聯(lián)合敲除Acsl6基因提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性等幾個(gè)方面展開(kāi)了深入研究。
　　目的:
　　1.明確MPLA體內(nèi)外輻射防護(hù)效應(yīng)

3、r>　　2.探索MPLA輻射防護(hù)作用的分子機(jī)制
　　3.檢測(cè)MPLA對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響
　　4.對(duì)癌細(xì)胞照后不同ACSL同工酶轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行篩選
　　5.驗(yàn)證Acsl6敲除提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性的作用
　　6.探究Acsl6敲除放射增敏機(jī)制
　　7.初步驗(yàn)證MPLA聯(lián)合ACSL6敲除可提高腫瘤放療效果。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理:采用HUVEC，L02，RAW264.7，LL

4、C和RM9細(xì)胞。MPLA給藥實(shí)驗(yàn)于IR前12小時(shí)加藥（1μg/ml用DMSO溶解），對(duì)照組給予相應(yīng)劑量DMSO。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用6-8周齡的野生型C57BL/6小鼠，TLR4(-/-)小鼠以及TRIF突變型小鼠(TRIFmutant)。MPLA給藥以生理鹽水溶解，劑量為1μg/mouse，0.1ml/mouse，方式為灌胃強(qiáng)飼，時(shí)間為IR前12h。
　　3.γ射線照射:第一部分采用海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心Co60

5、-γ射線照射源;第二部分采用美國(guó)德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心放射腫瘤學(xué)部分子放射生物學(xué)系137Cs-γ射線照射源。
　　4.細(xì)胞活力檢測(cè):采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　5.凋亡檢測(cè):采用AnnexinⅤ/PI雙染法以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　6.細(xì)胞周期檢測(cè):應(yīng)用PI單染法檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析。
　　7.動(dòng)物取材:照后不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，分離組織，制作單細(xì)胞懸液。
　　8.彗星電泳實(shí)驗(yàn):采用玻片雙層

6、凝膠法以中性細(xì)胞電泳進(jìn)行。
　　21.統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用Excel、SPSS21對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以GraphPad Prism6、SigmaPlot13.0進(jìn)行繪圖。兩組間比較用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行，P值小于0.05認(rèn)為其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　一、MPLA輻射防護(hù)作用及機(jī)制研究
　　1.MPLA可以有效減輕IR所致細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞照后DNA損傷修復(fù)
　　凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MPLA顯著降低了IR引起

7、的細(xì)胞凋亡;而細(xì)胞周期檢測(cè)顯示MPLA有效降低了IR導(dǎo)致的G2/M期周期阻滯;彗星電泳實(shí)驗(yàn)顯示MPLA有效減少了IR所致細(xì)胞核拖尾程度，且OTM和TM值均顯著降低。
　　2.MPLA對(duì)照后小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)的輻射防護(hù)作用
　　IR引起了小鼠骨髓空虛化且損傷程度呈進(jìn)行性加重，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)于照后第三天顯著降低，而MPLA明顯改善了這些損傷情況。同時(shí)，MPLA提高了照后小鼠B220-且CD34+骨髓細(xì)胞的比例。
　　3.M

8、PLA對(duì)小鼠脾臟具有TLR4依賴(lài)的輻射防護(hù)作用
　　IR引起了小鼠脾臟白髓面積、數(shù)目明顯縮小，而MPLA能夠有效增加其白髓范圍;脾細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，MPLA能夠明顯降低輻射引發(fā)的脾細(xì)胞凋亡率，并且有效扭轉(zhuǎn)了IR引發(fā)的脾細(xì)胞CD4+/CD8+比例失調(diào)。然而，這些MPLA對(duì)脾臟的輻射防護(hù)效果并未出現(xiàn)在TLR4-/-小鼠中，說(shuō)明了該效應(yīng)依賴(lài)TLR4而發(fā)揮。
　　4.MPLA可減輕小鼠的睪丸、小腸輻射損傷，提高照后動(dòng)物生存率

9、r>　　MPLA顯著改善了睪丸、小腸的組織學(xué)輻射損傷;且有效提高了不同致死劑量、不同照射方式下的動(dòng)物生存率。
　　5.MPLA的輻射防護(hù)作用依賴(lài)于TLR4
　　以TLR4-/-小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)MPLA未能扭轉(zhuǎn)IR對(duì)骨髓、脾臟等造成的組織學(xué)損傷，不能改善骨髓有核細(xì)胞、脾細(xì)胞等的輻射損傷，說(shuō)明MPLA的輻射防護(hù)作用依賴(lài)于TLR4受體而發(fā)揮。
　　6.MPLA激活TLR4后啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路(p38途徑）并且提高了NF

10、-kB p65核轉(zhuǎn)位及其轉(zhuǎn)錄活性
　　通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MPLA促進(jìn)了IKK-β的磷酸化，而免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示MPLA誘導(dǎo)了明顯的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，與此同時(shí)，熒光素酶檢測(cè)提示MPLA顯著提高了細(xì)胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄水平。
　　7.MPLA主要通過(guò)Myd88介導(dǎo)TLR4信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　以RAW264.7為研究對(duì)象，通過(guò)siRNA分別敲低TRIF以及Myd88基因，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。MPLA顯著降低了IR引起的WT及TR

11、IF KD細(xì)胞的凋亡率，而對(duì)Myd88KD細(xì)胞無(wú)保護(hù)作用。此外，通過(guò)對(duì)TRIFmutant小鼠組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MPLA僅部分改善了IR造成的骨髓細(xì)胞缺失，而對(duì)脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷無(wú)影響。
　　8.MPLA可改善IR引起的高炎性狀態(tài)以及Th1/Th2免疫失衡
　　以ELISA法檢測(cè)不同處理組小鼠血清細(xì)胞因子含量。結(jié)果顯示，MPLA+IR組中IL-6及TNF-α水平相對(duì)于IR組顯著降低;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MPLA能夠改善IR造成的小鼠

12、Th1/Th2免疫失衡。
　　9.MPLA對(duì)LLC、RM9輻射敏感性的影響
　　以LLC、RM9為研究對(duì)象，通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MPLA對(duì)癌細(xì)胞輻射敏感性的影響。結(jié)果顯示，MPLA均未增加兩種腫瘤細(xì)胞輻射抗性。
　　二、ACSL6對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響及其分子機(jī)制研究
　　1.ACSL系列同工酶對(duì)腫瘤細(xì)胞放射生物學(xué)反應(yīng)的影響篩選
　　通過(guò)qRT-PCR的手段分別對(duì)LLC及RM9IR之后ACSL五種同

13、工酶基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有Acsl6基因在IR之后48h顯著上調(diào);對(duì)于LLC，IR之后24h即出現(xiàn)了Acsl6的明顯增高。
　　2.構(gòu)建Acsl6敲除細(xì)胞系
　　利用CRISPR Cas9技術(shù)對(duì)LLC、RM9細(xì)胞成功進(jìn)行了Acsl6基因的敲除以及穩(wěn)定敲除細(xì)胞株的篩選。
　　3.Acsl6KO顯著降低了腫瘤細(xì)胞IR之后克隆形成能力
　　以LLC、LLC KO1、LLC KO3、RM9以及RM9KO為研究對(duì)象

14、，行克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的放射敏感性變化。結(jié)果顯示，所有基因敲除組細(xì)胞克隆形成能力明顯降低。
　　4.Acsl6KO參與LLC細(xì)胞Warburg效應(yīng)的調(diào)節(jié)
　　利用比色法檢測(cè)了細(xì)胞外L-乳酸含量，以反映細(xì)胞的有氧糖酵解水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將Acsl6敲除之后，LLC在IR之后2h、24h的乳酸水平顯著降低。然而，RM9細(xì)胞并未出現(xiàn)此現(xiàn)象。
　　5.Acsl6KO活化了LLC中能量代謝調(diào)控因子AMPK，但對(duì)RM9未產(chǎn)生明

15、顯影響
　　AMPK可以負(fù)向調(diào)節(jié)Warburg效應(yīng)，二者之間存在著緊密聯(lián)系。以WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AMPK在各細(xì)胞株的磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)在未照射或者10Gy照后，LLC KO1細(xì)胞在24h、48h時(shí)AMPKα磷酸化水平都顯著上調(diào)，而此現(xiàn)象未出現(xiàn)在RM9細(xì)胞中。
　　6.Acsl6KO增加了γ-H2AX焦點(diǎn)的形成
　　以LLC、LLC KO1、RM9、RM9KO等細(xì)胞株為研究對(duì)象，行γ-H2AX免疫熒光實(shí)驗(yàn)。Acsl6敲除后使LL

16、C、RM9核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)目都顯著增加，反映了其DNA損傷修復(fù)能力的降低。
　　7.Acsl6KO通過(guò)AMPK-P53通路提高癌細(xì)胞內(nèi)P53磷酸化水平及總P53濃度
　　WB結(jié)果顯示，Acsl6敲除后顯著提高了LLC、RM9內(nèi)P53磷酸化水平。IR提高了LLC中P53磷酸化水平，而敲除組細(xì)胞中升高更為明顯，P53總量也顯著上升;升高的磷酸化P53均可被ATM抑制劑KU-55933所阻斷，而后者反而增加了AMPK的磷酸化

17、水平。
　　結(jié)論:
　　基于激活NF-κB而發(fā)揮輻射防護(hù)作用的TLRs激動(dòng)劑在放射生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛重視，同時(shí)也是本室長(zhǎng)期關(guān)注、重點(diǎn)研究的課題之一。本課題分為兩個(gè)部分，分別對(duì)MPLA輻射防護(hù)作用及ACSL6敲除放射增敏進(jìn)行了研究:
　　第一部分中，首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了新型TLR4激動(dòng)劑MPLA能夠有效發(fā)揮多器官低毒高效的輻射防護(hù)作用，并且較為明晰地揭示了其所依賴(lài)的“TLR4-Myd88-MAPK(p38)-NF-κB

18、-糾正TH1/Th2、炎癥因子調(diào)節(jié)”信號(hào)通路。此外，初步證明了MPLA直接作用于癌細(xì)胞不增加其輻射抗性。
　　第二部分中，首次發(fā)現(xiàn)了IR能夠誘發(fā)癌細(xì)胞Acsl6基因轉(zhuǎn)錄特異性上調(diào);而敲除該基因之后，顯著增加了癌細(xì)胞的放射敏感性;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ACSL6調(diào)控癌細(xì)胞放射敏感性機(jī)制與Warburg效應(yīng)、ROS、自噬、G1阻滯及DNA損傷修復(fù)通路等緊密相關(guān);并且，MPLA聯(lián)合敲除ACSL6基因提高腫瘤放療效果展現(xiàn)了良好的前景，提供了諸多