基于放射敏感性的分子標(biāo)簽及放射增敏新策略的研究.pdf

1、第一部分：新型WNT通路抑制劑LGK974放射增敏作用和機(jī)制研究
　　目的：
　　探討WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑LGK974在腫瘤細(xì)胞中的放療增敏作用和機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)分別觀察 LGK974合并放療對(duì) MLH1表達(dá)完整和MLH1表達(dá)缺失的細(xì)胞株的放療增敏作用。
　　2.通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)分別觀察LGK974合并放療對(duì)瞬時(shí)導(dǎo)入MLH1結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116（MLH1表達(dá)是缺失的)的放

2、療增敏作用。
　　3.通過(guò)比較結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株（MLH1表達(dá)缺失）分別經(jīng)對(duì)照組DMSO和實(shí)驗(yàn)組LGK974處理后合并放療，用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中γH2AX的變化來(lái)反映LGK974通過(guò)抑制DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)MLH1缺失腫瘤細(xì)胞的放療敏感性。
　　4.通過(guò)蛋白激酶組學(xué)Kinomic Profiling實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LGK974放療增敏的可能磷酸化靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1. LGK974在MLH1表達(dá)完整的宮頸癌He

3、La細(xì)胞株中無(wú)放療增敏作用，而在MLH1表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株、子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞株、卵巢癌順鉑耐藥A2789/cp70細(xì)胞株中則有放療增敏作用。
　　2.野生型MLH1重新導(dǎo)入HCT116細(xì)胞株后LGK974的放療增敏作用明顯減弱。
　　3. LGK974相對(duì)對(duì)照組 DMSO而言，合并放療后 HCT116中檢測(cè)到的γH2AX數(shù)目明顯減少，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力降低，說(shuō)明LGK974有放療增敏作用；而把M

4、LH1導(dǎo)入HCT116后發(fā)現(xiàn)LGK974相對(duì)對(duì)照組DMSO而言，合并放療后HCT116中檢測(cè)到的γH2AX數(shù)目明顯增多，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，LGK974放療增敏作用減弱。
　　4.蛋白激酶組學(xué)實(shí)驗(yàn)（ Kinomic Profiling）發(fā)現(xiàn) LGK974合并放療后PRKACα和PRKACβ磷酸化作用減弱，提示它們可能為L(zhǎng)GK974放療增敏的潛在靶點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　作為一種新型Wnt信號(hào)通路抑制劑，LGK97

5、4在MLH-1表達(dá)缺失的腫瘤中通過(guò)抑制DNA損傷修復(fù)和作用于PRKACα和PRKACβ磷酸化靶點(diǎn)產(chǎn)生放療增敏作用。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明LGK974可能會(huì)成為一種新型的針對(duì)MLH1表達(dá)缺失腫瘤的放療增敏劑，PRKACα和PRKACβ磷酸化靶點(diǎn)有可能是潛在的放療增敏靶點(diǎn)。
　　第二部分：預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌放療敏感性MiRNA的篩選與驗(yàn)證
　　目的：
　　頭頸部鱗癌中預(yù)測(cè)放療敏感性MiRNA的篩選與驗(yàn)證
　　方法：
　　1.

6、通過(guò)選取一對(duì)分別取自共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥 ATM患者（患者）及其直系親屬（正常）的人淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系來(lái)分析miRNA差異表達(dá)與電離放射的關(guān)系，兩組分別經(jīng)放療和未放療處理后對(duì)比進(jìn)行完整的 miRNA芯片實(shí)驗(yàn)，得到28個(gè)表達(dá)有差異的miRNA。
　　2.在目前最大的癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)找尋病理類型為鱗狀細(xì)胞癌病例來(lái)評(píng)估這28個(gè)miRNA的臨床相關(guān)性。
　　3.利用MDA反向階段蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭

7、頸鱗癌樣本中的蛋白表達(dá)水平,分別計(jì)算 ATM在放射敏感和放射抗拒的患者中的平均表達(dá)水平。
　　4.通過(guò)檢測(cè)頭頸鱗癌細(xì)胞系 Cal27，驗(yàn)證放射治療前后在抑制或不抑制ATM情況下的miRNA表達(dá)譜與最初的miRNA篩選結(jié)果及TCGA臨床數(shù)據(jù)一致。5.利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(一個(gè)搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng))（STRING9.1），對(duì)這5個(gè)可預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌放射敏感性的miRNA分子的調(diào)控目標(biāo)進(jìn)行通路分析（pathw

8、ay analysis）。
　　結(jié)果：
　　共有28個(gè)miRNA在放射治療后出現(xiàn)不同的差異表達(dá)，但都依賴于共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變（Ataxia-Telangiectasia Mutated，ATM）激酶。通過(guò)驗(yàn)證這些miRNA最終確認(rèn)有5個(gè)miRNA分子標(biāo)志物可預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌放射敏感性，且這些患者中的ATM表達(dá)水平與放射敏感性相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　miRNA分子標(biāo)志物可用于臨床預(yù)測(cè)頭頸鱗癌放射治療的敏感性

9、。
　　第三部分：RAS蛋白促進(jìn)人腦膜瘤細(xì)胞增殖且抑制其凋亡
　　目的：
　　探討RAS蛋白對(duì)人腦膜瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　方法：
　　將人腦膜瘤 IOMM-LEE細(xì)胞分為空白對(duì)照組(細(xì)胞未進(jìn)行任何藥物處理)、陰性對(duì)照組(細(xì)胞經(jīng)等體積生理鹽水代替藥物)和FTS處理組（細(xì)胞經(jīng)FTS處理），采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)，F(xiàn)TS(75μmol/L)處理48h后采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)降低RAS活性后

10、IOMM-LEE細(xì)胞的增殖和凋亡情況，用Western Blot檢測(cè)ERK和AKT信號(hào)通路；按腎包膜下移植法建立人腦膜瘤動(dòng)物模型，小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(50 mg/kg組、75 mg/kg組和100 mg/kg，皮下注射FTS)和對(duì)照組，免疫組化增殖細(xì)胞檢測(cè)核抗原(PCNA)，用Western Blot檢測(cè)ERK和AKT信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在75μmol/L FTS濃度下，IOMM-LEE細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的推

11、移而明顯下降(P＜0.05)。75μmol/L FTS濃度處理48h后，處理組細(xì)胞凋亡較空白組及陰性對(duì)照組均明顯增加(均P＜0.05)；且細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組及陰性對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。75μmol/L FTS濃度處理48h后，相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，處理組ERK和AKT的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：FTS處理后，與對(duì)照組和50mg/kg組相比，7