姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma)是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。骨肉瘤由于惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，較早出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，因而骨肉瘤患者的預(yù)后非常差。近年來隨著輔助化療和新輔助化療的應(yīng)用，患者的生存率得到明顯的改善，保肢手術(shù)逐步取代截肢手術(shù)。然而對于某些特殊的骨肉瘤患者，如腫瘤生長在脊柱、顱底、骨盆等特殊部位以及術(shù)后復(fù)發(fā)或多處轉(zhuǎn)移的晚期病人，手術(shù)往往難以進(jìn)行而只能進(jìn)行姑息性治療，但僅僅通過大劑量的化療

2、，往往在帶來顯著的副作用的同時(shí)臨床療效卻不盡如人意。因此對于骨肉瘤這類放療不敏感的腫瘤類型，如果能夠找到一條放射增敏的途徑，充分利用放射治療的優(yōu)勢，將在一定程度上改善骨肉瘤患者的治療現(xiàn)狀。
　　 放射增敏研究是腫瘤學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，對于改善臨床放射治療的療效具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的放射敏感性與細(xì)胞DNA損傷的自我修復(fù)能力有關(guān)，由共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(AtaxiaTelangiectasia Mutated，ATM)蛋

3、白介導(dǎo)的DNA損傷的自我修復(fù)過程是近年來的研究熱點(diǎn)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，某些藥物能通過使ATM表達(dá)下降而達(dá)到放射增敏的作用。本課題以人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞為研究模型，姜黃素為研究對象，較為系統(tǒng)地研究了姜黃素對人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞的放射增敏作用，并以ATM參與的細(xì)胞DNA損傷自我修復(fù)能力作為切入點(diǎn)，深入探討了姜黃素放射增敏的分子機(jī)制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 第一部分姜黃素與X射線聯(lián)合應(yīng)用對人骨肉瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響
　　

4、 目的：
　　 通過觀察姜黃素聯(lián)合X射線對人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，了解姜黃素對人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞是否具有放射增敏作用。
　　 方法：
　　 選取人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞作為研究對象，將細(xì)胞分為對照組、單獨(dú)姜黃素處理組、單獨(dú)放射處理組、姜黃素與放射聯(lián)合處理組。分別應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測姜黃素與X射線聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞增殖活性的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測姜黃素與X射線聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞周期及

5、細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 MTT實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素與X射線聯(lián)合處理能顯著提高人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞增殖抑制率，且姜黃素濃度越大抑制作用越強(qiáng)，作用時(shí)間越長抑制作用越強(qiáng)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素與X射線聯(lián)合作用下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于對照組。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素與X射線聯(lián)合作用引起細(xì)胞S期阻滯。
　　 結(jié)論：
　　 姜黃素對人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞增殖有抑制作用，而且隨著姜黃素濃度的增大，作用時(shí)

6、間的增長，抑制作用增強(qiáng)。姜黃素能夠作為一種有效的放射增敏藥物提高人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞的放射敏感性，其機(jī)制可能與細(xì)胞的S期阻滯有關(guān)。
　　 第二部分抑制ATM的表達(dá)對人骨肉瘤細(xì)胞放射敏感性的影響
　　 目的：
　　 探討姜黃素是否能通過靶向抑制人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞ATM基因的表達(dá)，從而影響放射處理后人骨肉瘤細(xì)胞DNA損傷的自我修復(fù)能力。
　　 方法：
　　 利用Real-time PCR和Wes

7、tern Blot技術(shù)檢測RNA干涉后ATM的表達(dá)。將細(xì)胞分為NCsiRNA處理組、NCsiRNA聯(lián)合放射組、ATMsiRNA組和ATMsiRNA聯(lián)合放射組。利用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分別檢測X射線對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。并利用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)探討姜黃素與人骨肉瘤細(xì)胞ATM表達(dá)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 ATMsiRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞后，利用Real-tim

8、e PCR和Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)ATM表達(dá)下降。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATMsiRNA與X射線聯(lián)合作用下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于對照組。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)ATMsiRNA與X射線聯(lián)合作用能引起細(xì)胞S期阻滯。利用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素處理人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞，其ATM表達(dá)下降。
　　 結(jié)論：
　　 在ATM基因沉默后，人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞的放射敏感性增加;并且姜

9、黃素能夠抑制ATM的表達(dá)。
　　 第三部分抑制NF-κB的活性影響姜黃素對ATM表達(dá)的調(diào)控
　　 目的：
　　 探討姜黃素是否能通過抑制NF-κB的活性影響人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞的ATM的表達(dá)，從而影響放射處理后人骨肉瘤細(xì)胞DNA損傷的自我修復(fù)能力。
　　 方法
　　 利用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測RNA干涉后的NF-κB的表達(dá)。將細(xì)胞分為NCsiRNA處理組、N

10、F-κ BsiRNA組、NCsiRNA聯(lián)合姜黃素組和NF-κBsiRNA聯(lián)合姜黃素組。利用Real-timePCR和Western Blot技術(shù)檢測NF-κ BsiRNA轉(zhuǎn)染后姜黃素對X射線對人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞ATM表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 NF-κBsiRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞后，利用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測NF-κB表達(dá)下降。利用Real-time PCR和We