基于腸道菌群失調(diào)并過敏性哮喘大鼠TLRs-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及腸道菌群16SrDNA的“肺與大腸相表里”免疫機(jī)制研究.pdf

1、目的：1.構(gòu)建腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠模型；2.初步探索腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型中肺、腸免疫與腸道菌群的關(guān)系及作用機(jī)制；3.分別從肺腸合治、治肺法和治腸法三個(gè)方面治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠，以比較、驗(yàn)證治肺法、治腸法與肺腸合治法對(duì)模型大鼠的有效性，進(jìn)一步探索和驗(yàn)證腸道微生態(tài)和肺、腸免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系與機(jī)制，為中醫(yī)理論“肺與大腸相表里”的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.予SD大鼠飲用頭孢哌酮水溶液和

2、灌胃白色念珠菌造成大鼠腸道菌群紊亂，再利用皮下注射和霧化吸入卵清蛋白的方式構(gòu)建腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型。分別從個(gè)體、組織細(xì)胞、分子水平評(píng)價(jià)模型的有效性；
　　2.通過分析腸道菌群16SrDNA以及TLRs/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TOLL樣受體2（TOLL-like receptors2，TLR2）、TLR4、MyD88、TARF6和β-arrestin mRNA在肺和腸組織的表達(dá)水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析，探索腸道菌群失調(diào)合并

3、過敏性哮喘肺部免疫與腸道免疫的關(guān)系及作用機(jī)制；
　　3.以“升降散”、“桂枝加厚樸杏子湯”和“增液承氣湯”灌胃模型大鼠，從個(gè)體、細(xì)胞和分子水平進(jìn)行檢測(cè)分析，以比較、驗(yàn)證治肺法、治腸法與肺腸合治法對(duì)模型大鼠的有效性，進(jìn)一步探索和驗(yàn)證腸道微生態(tài)和肺部免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系與作用機(jī)制，為中醫(yī)理論“肺與大腸相表里”的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1.腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型的構(gòu)建及有效性評(píng)價(jià)
　　模型組大鼠跟空白

4、組比較，呼吸頻率顯著上升，肺泡灌洗液（BALF）和
　　血液中嗜酸性粒細(xì)胞以及血液中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著升高，肺組織切片出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，血液中IgE顯著升高，sIgA顯著降低，各種改變均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明模型組發(fā)生了典型的哮喘相關(guān)的病理學(xué)改變；模型組BALF中IL-4和IFN-γ的含量跟空白組比較均發(fā)生了顯著性改變，具體表現(xiàn)為IL-4升高，IFN-γ降低，肺組織中GATA-3 mRNA的表達(dá)水平顯著性

5、高于空白組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明模型組大鼠出現(xiàn)了以Th2增多為主的Th1/Th2失衡。
　　2.肺、腸道免疫與腸道菌群機(jī)制研究
　　模型組腸道菌群多樣性比空白組明顯降低，腸道正常菌群擬桿菌門和變形菌們減少，同時(shí)有害菌群梭狀芽孢桿菌和幽門螺旋桿菌增加，陽性組腸道菌群多樣性逐漸恢復(fù)。模型組的肺組織中TLR4與MyD88、TRAF6、β-arrestin mRNA表達(dá)量比空白組和陽性組均顯著性升高（P<0.05），除了TRAF6

6、 mRNA其余三個(gè)mRNA變化呈正相關(guān)性；模型組的腸組織中TLR4與MyD88、TRAF6、β-arrestin mRNA表達(dá)量均高于空白組和陽性組，但只有TLR4 mRNA表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)MyD88、TRAF6和β-arrestin的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)性。
　　3.三種治法對(duì)模型動(dòng)物影響的比較
　　“加味升降散”對(duì)模型大鼠無論在呼吸頻率、氣道高反應(yīng)性、肺組織病理切片分析、BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目以及IgE的

7、變化，以及T-bet/GATA-3和IFN-γ、IL-4含量變化均具有最佳的調(diào)節(jié)作用，且都與模型組差異顯著（P<0.05），對(duì)腸道菌群多樣性具有恢復(fù)作用但是不如治腸組；“增液承氣湯”對(duì)腸道菌群多樣性的恢復(fù)效果最佳，對(duì)氣道高反應(yīng)性、BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性細(xì)胞數(shù)量以及血液中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量均有很好的調(diào)節(jié)作用（P<0.05）；“桂枝加厚樸杏子湯”對(duì)腸道菌群多樣性的恢復(fù)不如治腸組，對(duì)模型動(dòng)物呼吸頻率的改善和調(diào)節(jié)血液中嗜酸性粒細(xì)

8、胞都有明顯的優(yōu)勢(shì)，還能有效地升高Th1分化細(xì)胞特有的細(xì)轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA的表達(dá)量（P<0.05）。各治療組肺組織中TLR2、MyD88和TRAF6 mRNA的表達(dá)水平均顯著性地低于模型組（P<0.05），只有治肺組和肺腸合治組肺組織的TLR4和β-arrestin mRNA的表達(dá)量均低于模型組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各治療組腸組織中TLR2、MyD88和TRAF6 mRNA的表達(dá)水平均高于模型組，但只有TLR2在肺腸合治組和治肺組以

9、及TRAF6在治肺組和治腸組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；只有治腸組的β-arrestin mRNA的表達(dá)量高于模型組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.通過灌胃大鼠頭孢哌酮和白色念珠菌，利用卵清蛋白進(jìn)行致敏和霧化，成功構(gòu)建了腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型；
　　2．過敏性哮喘合并腸道菌群失調(diào)大鼠模型中，依賴于MyD88的TLRs/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同時(shí)參與了肺部和腸道的免疫調(diào)節(jié)，β-arrestin作為上游調(diào)節(jié)因子對(duì)該

10、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有正向調(diào)節(jié)作用，肺組織中TLRs/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)Th1/Th2具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　3.各治療組無論對(duì)腸道菌群的多樣性的恢復(fù)還是對(duì)過敏性哮喘相關(guān)病理指標(biāo)的改善均具有促進(jìn)作用，說明三種方法均能同時(shí)調(diào)節(jié)肺和腸的免疫狀態(tài)，只是各治療組對(duì)不同病理指標(biāo)的作用程度有差異。綜合各項(xiàng)病理指標(biāo)肺腸合治組效果最佳。各治療組均通過TLRs/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)到通路參與腸和肺的免疫調(diào)節(jié)，但是在肺組織中通過下調(diào)依賴于MyD88的TL