干擾HDAC2基因?qū)π∈笤缙谂咛ソM蛋白修飾的影響.pdf

1、表觀遺傳修飾如組蛋白修飾、DNA甲基化等在調(diào)控基因的表達與沉默中起重要作用。HDAC2為組蛋白去乙?；赋蓡T，主要在染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄抑制方面發(fā)揮作用。本研究運用RNA干擾技術(shù)對小鼠HDAC2進行了干擾，通過抑制組蛋白去乙?；傅谋磉_提高乙?；揎椝?，以探索表觀遺傳修飾影響哺乳動物胚胎早期發(fā)育的可能機制。
　　 1.HDAC2干擾表達載體的構(gòu)建與細(xì)胞水平上的效應(yīng)檢測
　　 根據(jù)已公布的小鼠HDAC2基因mRNA序列，以及

2、shRNA設(shè)計原則，選擇第107-126、879-898和1240-1259三個區(qū)段為靶點設(shè)計合成干擾片段，同時設(shè)計陰性對照序列。分別成功構(gòu)建了四個表達紅熒光蛋白的干擾載體，即pCDsRed2-shRNA107、pCDsRed2-shRNA879、pCDsRed2-shRNA1240、和作為對照的pCDsRed2-shRNAcontrol。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的四個干擾載體轉(zhuǎn)染入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，48小時后分析轉(zhuǎn)染效果并進行篩選

3、。利用實時定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因的表達量。結(jié)果表明，上述4個干擾載體引起目的基因的表達量分別為對照組細(xì)胞中的0.72倍、0.73倍、0.13倍和0.8倍。因此確定出HDAC2基因下游區(qū)域的1240位點處是最有效的干擾區(qū)域。把干擾載體分別轉(zhuǎn)染入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，篩選出陽性細(xì)胞。對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進行組蛋白乙酰化與甲基化修飾的檢測。發(fā)現(xiàn)不同干擾載體引起的細(xì)胞的H4K5ac、H3K9ac、H3K9me2、H3K27me3、H3K4m

4、e3熒光信號有明顯差異。在3個載體中，干擾效率最高的是pCDsRed2-shRNA1240載體，組蛋白乙?；揎椥盘栕顝姟６诩谆揎椫?，除組蛋白H3K9m2沒有明顯信號外，其他位點均表現(xiàn)出最強信號。因而，我們選用pCDsRed2-shRNA1240干擾載體作下一步的胚胎發(fā)育驗證。
　　 2.干擾HDAC2表達對小鼠胚胎早期發(fā)育的影響
　　 利用原核注射技術(shù)，將hdac2的shRNA注射到受精卵中，然后分別收集干擾后發(fā)

5、育到2-細(xì)胞，8-細(xì)胞和囊胚期的胚胎，通過RT-PCR對胚胎進行檢測。發(fā)現(xiàn)在注射組各時期胚胎中hdac2的mRNA水平分別是對照組的96.6％，85.3％和35.6％。表明，干擾HDAC2的表達影響了小鼠胚胎發(fā)育。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，干擾處理的2-細(xì)胞，8-細(xì)胞和囊胚期胚胎中的乙酰化和甲基化位點出現(xiàn)修飾差異。除了H3K9me2之外，H3K9ac、H4K5ac、H3K4me3和H3K27me3在胚胎的不同發(fā)育階段均高水平表達。這種修飾差