NSC668394對小鼠卵子成熟、早期胚胎及性腺發(fā)育的影響.pdf

1、Ezrin是ERM（Ezrin/Radixin/Moesin,ERM）蛋白家族成員之一，是通過跨膜蛋白將肌動蛋白細胞骨架連接到細胞外基質(zhì)的一種多功能蛋白。Ezrin參與了細胞重塑、細胞粘附、細胞運動、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin與動物的生殖活動關(guān)系密切，參與了卵母細胞成熟、早期胚胎發(fā)育、精子發(fā)生和獲能及子宮內(nèi)膜發(fā)育和胚胎著床。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段的小鼠卵巢和睪丸組織，以及小鼠不同發(fā)育階段的卵母細胞和

2、早期胚胎均呈p-Ezrin Thr567抗體染色陽性，但其具體作用目前尚不十分清楚。NSC668394是近年來發(fā)現(xiàn)的一種特異性抑制Ezrin Thr567磷酸化的小分子化合物。本課題以NSC668394為工具，研究Ezrin Thr567磷酸化在小鼠卵母細胞成熟、受精、胚胎早期發(fā)育及性腺發(fā)育過程中的作用，對于豐富哺乳動物卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育調(diào)控理論具有重要意義。試驗包括以下四部分：
　　試驗一：NSC668394對小鼠

3、卵母細胞體外成熟、體外受精及早期胚胎發(fā)育的影響。將小鼠GV期卵母細胞、體內(nèi)MII期卵母細胞和原核期胚胎隨機分成5組，分別培養(yǎng)于添加0、2.5、5.0、10.0μM的NSC668394和0.1％DMSO的體外培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)液中添加NSC668394不僅影響卵母細胞成熟率，而且影響到成熟卵母細胞、體內(nèi)MII期卵母細胞的受精率和后續(xù)體外受精胚和原核期胚的早期胚胎發(fā)育，其中2.5μM組的卵母細胞體外成熟率、體外受精率和體內(nèi)MII期卵

4、母細胞體外受精率顯著低于其余各組（P＜0.05）；10.0μM組在后續(xù)的胚胎發(fā)育中絕大部分停滯在2-細胞期，2.5和5.0μM組的桑椹胚和囊胚發(fā)育率顯著低于對照組（P＜0.05）。
　　試驗二：NSC668394所造成的卵母細胞體外成熟、體外受精及體外發(fā)育阻滯的挽救試驗。將GV期小鼠卵母細胞、體內(nèi)MII期卵母細胞和原核期胚胎隨機分成4組，分別培養(yǎng)于含0μM（I組）、2.5μM（II組）NSC668394或含0.1%DMSO（III

5、組）的體外培養(yǎng)基中，IV組卵細胞、體內(nèi)MII期卵母細胞和原核期胚胎顯微注射 Ezrin T567D的mRNA后培養(yǎng)于添加2.5μM NSC668394的體外培養(yǎng)基，并進行體外受精及早期胚胎發(fā)育。結(jié)果顯示：IV組卵母細胞體外成熟率、體外受精率顯著高于II組（P＜0.05），但顯著低于I組和III組（P＜0.05）；IV組的體內(nèi)MII期卵母細胞體外受精率和早期胚胎發(fā)育率顯著高于II組（P＜0.05），但顯著低于I組和III組（P＜0.05）

6、；IV組的原核期胚胎的桑葚胚和囊胚發(fā)育率顯著高于II組（P＜0.05），但顯著低于I組和III組（P＜0.05）。
　　試驗三：3 w齡斷奶鼠腹腔注射NSC668394（試驗組）或0.1%DMSO（對照組）對小鼠卵母細胞體外成熟、體外受精及早期胚胎發(fā)育的影響。腹腔注射NSC668394待其小鼠發(fā)育至性成熟，將小鼠卵母細胞進行體外成熟、體外受精及早期胚胎發(fā)育，小鼠原核期胚胎在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。結(jié)果顯示腹腔注射NSC668394不影響

7、卵母細胞的體外成熟率，但卵母細胞的體外受精率和體外受精胚的桑椹胚率和囊胚率都顯著低于腹腔注射0.1%DMSO組。腹腔注射NSC668394能顯著降低原核受精卵的桑椹胚率和囊胚率。Western Blot檢測結(jié)果顯示試驗組小鼠睪丸和卵巢上p-Ezrin(Thr567)表達低于腹腔注射0.1%DMSO組。
　　試驗四：妊娠10.5 d和3 w斷奶期鼠腹腔注射NSC668394對小鼠生長發(fā)育、性腺發(fā)育及 Ezrin和 p-Ezrin(T

8、hr567)表達定位的影響。結(jié)果顯示，與腹腔注射0.1%DMSO相比，注射NSC668394組的妊娠母鼠和仔鼠的增重顯著低于注射0.1%DMSO組，HE染色發(fā)現(xiàn)從出生發(fā)育到斷奶期小鼠的睪丸直徑和厚度顯著低于0.1%DMSO組（P＜0.05）；注射NSC668394組的斷奶期發(fā)育到性成熟鼠的增重顯著低于注射0.1%DMSO組，HE染色發(fā)現(xiàn)從出生發(fā)育到斷奶期小鼠的睪丸直徑和厚度顯著高于0.1%DMSO組（P＜0.05）。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)腹腔

9、注射NSC668394其Ezrin和p-Ezrin(Thr567)表達定位無變化；注射NSC668394對卵巢的發(fā)育沒有影響。
　　綜上所述，培養(yǎng)液中添加NSC668394可降低小鼠卵母細胞體外成熟率、受精率和早期胚胎發(fā)育率；顯微注射模擬Ezrin Thr567磷酸化的突變體Ezrin T567D的mRNA可挽救由NSC668394造成的小鼠卵母細胞體外成熟、體外受精及早期胚胎發(fā)育障礙。孕鼠和斷奶鼠腹腔注射NSC668394影響了