人早孕因子表達(dá)與促細(xì)胞生長模型的初步建立.pdf

1、早孕因子(early pregnancy factor, EPF)是哺乳動物妊娠早期母體血清中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子。具有免疫抑制和生長調(diào)節(jié)兩種功能，為目前最早確認(rèn)妊娠的生化指標(biāo)之一。小鼠受精后6h，豬、牛、山羊24h，人受精48h即可從母體內(nèi)測出EPF，這些遠(yuǎn)早于人絨毛膜促性腺激素(hCG)測定，而且EPF的活性可以在妊娠期存在很長時間，因此對EPF的活性檢測可用于牛、馬的早期妊娠診斷。EPF在孕婦的超早孕診斷中準(zhǔn)確率達(dá)88.6％

2、，因此，EPF在早孕診斷方面的應(yīng)用，將對人類及畜牧業(yè)有重要的意義。
　　 為獲得人早孕因子重組蛋白，提取人肝癌SMMC-7721細(xì)胞總RNA，對早孕因子基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、TA克隆和測序，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增人早孕因子基因，克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET-28a，分別與GST基因和his基因相融合，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，經(jīng)異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，以SDS-PAG

3、E和Western blot分析重組蛋白的表達(dá)，通過GST樹脂和純化表達(dá)蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX6p-EPF，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了GST-EPF融合蛋白，表達(dá)蛋白分子量為37.3kDa，并能被抗GST單克隆抗體特異識別，通過GST親和層析純化，制備得到EPF重組蛋白，pET28-EPF重組質(zhì)粒成功構(gòu)建，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了his-EPF融合蛋白，表達(dá)蛋白分子量為17kDa，并能被抗his單抗特異識別，通過鎳柱純化得蛋白