殘余腎模型早期微血管改變和胎盤生長因子表達的初步研究.pdf

1、多種人類疾病都有微血管病變的參與，但是微血管病變在腎臟病中的作用卻少有關注。既往對人類疾病和動物模型的研究證明，內皮細胞損傷可導致氧和營養(yǎng)成份運輸?shù)侥I小管、間質的障礙，引起慢性缺血。慢性缺血繼而引起慢性缺氧，從而導致一系列病變，包括：肌成纖維細胞增生、細胞外基質合成和誘導細胞調亡，最終導致腎臟纖維化、腎功能減退。用血管內皮細胞生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)治療大鼠殘腎模型促進腎小球和

2、腎小管周圍毛細血管內皮細胞增生，可明顯改善腎功能，而且膠原Ⅲ合成減少。因此，維護微循環(huán)的穩(wěn)定對腎功能保護有重要意義，改善微血管病變可以延緩腎功能減退。 既往對大鼠殘余腎模型的研究發(fā)現(xiàn)，8周后腎功能呈進行性惡化。有趣的是，在模型早期可能有短暫的微血管反應。盡管Kang等人認為VEGF丟失和抗血管生長因子(Thrombospondin-1，TSP-1)表達上調在該模型中發(fā)揮著一定的作用，但內皮細胞增生的具體機制尚不清楚。 胎

3、盤生長因子(PlacentaGrowthFactor,PlGF)，是VEGF家族中的新成員。近年來發(fā)現(xiàn)PlGF可以結合其受體VEGFR-1(Flt-1)，傳導細胞內信號，對病理性微血管發(fā)生有促進作用，但不影響其生理過程。相反，阻斷VEGFR-1可以改善以微血管過渡生長為特征的疾病，如：可以抑制腫瘤、類風濕性關節(jié)炎等的血管新生。近來基因研究證明，PlGF和VEGFR-1是介導病理性血管增生的唯一關鍵因素。這些均表明，PlGF對微血管增生有

4、重要意義。 PlGF在殘余腎模型早期階段微血管反應中的作用尚不清楚。因此，本研究探討：①大鼠殘余腎模型早期腎功能變化的特征；②大鼠殘腎模型早期微血管病變，及其與腎功能代償之間的相關關系；③大鼠殘余腎模型早期PlGF的表達。 第一章大鼠殘余腎模型早期腎功能變化的觀察一、目的探討大鼠殘余腎模型早期腎功能和血壓的變化規(guī)律。 二、材料和方法1.模型建立48只SD大鼠隨機分成兩組：假手術組和殘腎模型組。24只大鼠行5/6腎

5、切除手術：結扎右側腎動脈并結扎左側腎動脈三個分支中的兩只。同時，24只大鼠行假手術，開腹，觸其左腎，關腹。每周測體重。假手術組和殘腎組在手術后第1、2、3、4周各殺六只大鼠。實驗方案得到中山大學動物委員會動物實驗指南的允許。 2.血壓、尿素氮、肌酐的檢測應用電腦自動血壓心率儀(日本SoftronBP-98A)，采用尾套法，每周檢測尾動脈收縮壓。肌酐檢測采用苦味酸法檢測，由腎病實驗室檢測。 3.統(tǒng)計學分析計量資料用均數(shù)士標

6、準差表示，組間差異比較用單因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理。 三、結果模型建立后，假手術組大鼠的體重隨著時間進展持續(xù)上升，而殘余腎模型組大鼠體重明顯低于假手術組，到實驗第四周時，假手術組大鼠的體重約是殘腎組大鼠體重的1.3倍。 模型后第一周，殘腎組大鼠的BUN、Scr和血壓明顯上升，但其后第2周到第4周，上述指標一直都維持在穩(wěn)定水平，而不

7、是持續(xù)性進展。假手術組大鼠的BUN、Scr和BP則無明顯變化。 四、小結殘余腎模型早期，大鼠腎功能和血壓維持穩(wěn)定，而不是持續(xù)進展，提示有代償機制的參與。 第二章大鼠殘余腎模型早期微血管病變一、目的觀察大鼠殘余腎模型早期微血管改變，并探討腎功能改變和微血管反應之間的關系。 二、材料和方法1.免疫組化染色腎組織石蠟切片行免疫組化染色，內皮細胞用小鼠抗大鼠內皮細胞單克隆抗體(RECA-1)標記。殘腎組和假手術組腎組織石

8、蠟切片用RECA-1單抗和小鼠抗增生細胞核抗原(PCNA)單抗(PC10)行免疫雙重免疫組織化學染色，雙重染色陽性細胞(RECA-1+PCNA+細胞)為增生的內皮細胞。 2.免疫組化的量化每只動物計算至少20個高倍視野(×400)腎小球橫切面(glomerularcrosssection，gcs)中毛細血管數(shù)并求得平均值，得出腎小球毛細血管指數(shù)(glomerularcapillaryindex，GCI)；計算腎皮質至少20個顯微

9、鏡高倍視野(hpf)(×400)腎小管周圍毛細血管指數(shù)(peritubularcapillaryindex，PCI)。同時計算至少20個腎小球橫切面和至少20個高倍視野(×400)中RECA-1+PCNA+細胞(增生內皮細胞)數(shù)，并求和取平均值，得每個腎小球橫切面的增生內皮細胞數(shù)的均值。 3.統(tǒng)計學分析計量資料用均數(shù)士標準差表示，組間差異比較用單因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均

10、用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理。 三、結果1.大鼠殘余腎模型早期微血管改變與假手術組相比，殘腎組平均每個腎小球橫截面的RECA-1+毛細血管襻呈上升趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義。相反，殘腎組腎小管平均周圍毛細血管密度術后明顯降低，直到第四周。 2.大鼠殘余腎模型早期微血管增生改變殘腎組腎小球毛細血管增生在模型建立后明顯上調，第二周時達到高峰，平均每個腎小球橫截面的RECA-1+PCNA+較假手術大鼠升高約3倍。腎小管周圍內

11、皮細胞增生也在第一周時達高峰，此后開始下降，實驗結束時，腎小球和腎小管周圍內皮細胞增生都回到基線水平。 四、小結1.大鼠殘余腎模型早期有顯著的微血管反應； 2.微血管反應出現(xiàn)在腎功能的穩(wěn)定階段； 3.這種微血管反應參與了延緩早期的腎臟病變進展。 第三章殘腎模型早期胎盤生長因子的表達一、目的探討大鼠殘腎模型早期腎組織PlGF的表達。 二、材料和方法1.細胞培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞、系膜細胞和巨噬細胞放

12、入培養(yǎng)條件為37℃，95％空氣和5％CO2的細胞培養(yǎng)箱。這三種細胞株，分別用DMEM(腎小管上皮細胞)和RPMI1640(系膜細胞和巨噬細胞)培養(yǎng)基。 2.RT-PCR腎組織提總RNA，RT-PCR檢測胎盤生長因子(PlGF)mRNA的表達，以β-Actin為內參照，計算相對單位，并與假手術組比較。 3.WesternBlot取左腎組織蛋白，WesternBlot檢測PlGF的表達，以β-Actin為內參照，計算與內參照

13、比值，并與假手術組比較。 4.統(tǒng)計分析計量資料用均數(shù)士標準差表示，組間差異比較用單因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理。 三、結果1.腎組織PlGFmRNA表達RT-PCR結果顯示，PlGFmRNA表達在第一周和第二周，較假手術組相比，分別上調2.8倍和2.7倍。第四周時，PlGFmRNA表達回復到基線水平。 2.腎組織PlGF蛋白表

14、達Westernblot結果顯示，假手術組僅有微量的PlGF蛋白表達。與假手術組比較，殘腎組PlGF蛋白表達在第一周和第二周上調3.9和3.2倍。 3.腎細胞PlGF蛋白表達Westernblot結果顯示，腎小管上皮細胞PlGF蛋白表達最強。巨噬細胞PlGF蛋白表達最弱。系膜細胞表達居于兩者之間。 四、小結1.PlGF可能是大鼠殘余腎模型中微血管發(fā)生的主要動力； 2.腎小管上皮細胞是PlGF的主要來源。