基于早孕因子檢測(cè)的奶牛早孕診斷ELISA方法的建立.pdf

1、在奶牛的繁育過(guò)程中，奶牛的早期妊娠診斷非常重要。早孕因子（early pregnancy factor，EPF）是目前所知最早確認(rèn)妊娠的生物化學(xué)標(biāo)志物之一，是顯示胚胎成活力的敏感標(biāo)志。血清中早孕因子的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)胚胎的形成，監(jiān)測(cè)胎兒生長(zhǎng)狀態(tài)，檢測(cè)胚胎的早期消失。如果能在家畜上利用 EPF進(jìn)行早期妊娠診斷，可以在配種后很短的時(shí)間內(nèi)鑒別奶牛是否受孕，此技術(shù)縮短產(chǎn)犢間隔，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高奶牛的繁殖率，同時(shí)也有利于育種員及時(shí)掌握配種情況，在實(shí)

2、際生產(chǎn)中具有重要意義。
　　本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)克隆奶牛 EPF基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體 pET32a-EPF，獲得奶牛早孕因子重組蛋白，通過(guò)切膠純化的方法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，最終建立了奶牛早期妊娠診斷的間接 ELISA檢測(cè)方法。利用該方法對(duì)懷孕28天的奶牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠抗牛 EPF多克隆抗體與孕酮、人絨毛膜促性腺激素均不發(fā)生交叉反應(yīng)；早孕因子重組蛋白的最低檢出限為320ng/mL；妊娠奶牛血清樣本的敏感性為91

3、％（n=100）；批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均低于10%；與美國(guó)愛(ài)德士牛懷孕檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，本研究建立的 ELISA檢測(cè)方法符合率為81.97%；對(duì)間接 ELISA法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，妊娠奶牛(n=99)比空懷奶牛(n=92)血清中 EPF活性高，且差異極顯著(P<0.01)；2～3歲妊娠奶牛(n=55)血清中 EPF活性比4～5歲妊娠奶牛(n=28)高，且差異極顯著（P<0.01）；2～3歲妊娠奶牛(n=55)與