端粒相關(guān)因子表達(dá)與細(xì)胞復(fù)制性衰老關(guān)系研究.pdf

1、衰老是細(xì)胞的重要生命現(xiàn)象，研究細(xì)胞衰老的發(fā)生及調(diào)節(jié)機(jī)理是人類認(rèn)識(shí)生命規(guī)律的重要組成內(nèi)容，同時(shí)也為衰老相關(guān)疾病的防治提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，端粒長(zhǎng)度的縮短是造成細(xì)胞復(fù)制性衰老的原因，而端粒的長(zhǎng)度受端粒相關(guān)因子的調(diào)節(jié)。因此，研究端粒相關(guān)因子與細(xì)胞復(fù)制性衰老之間的關(guān)系能夠揭示細(xì)胞衰老機(jī)制。 Hayflick證實(shí)在體外培養(yǎng)的人二倍體成纖維細(xì)胞隨所傳代數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力逐漸喪失，Hayflick將這種人正常體細(xì)胞在體外

2、分裂潛能受限的現(xiàn)象稱為細(xì)胞復(fù)制性衰老。人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)屬于二倍體成纖維細(xì)胞，具有復(fù)制性衰老的特性，因此選用HEL細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)建立HEL細(xì)胞復(fù)制性衰老模型，來(lái)模擬正常細(xì)胞的衰老過(guò)程。 目前已發(fā)現(xiàn)與端粒相關(guān)的因子有很多，這些因子調(diào)節(jié)細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度的變化，在細(xì)胞復(fù)制性衰老過(guò)程中發(fā)揮各自不同的重要作用。研究表明，TRF1調(diào)節(jié)POT1與端粒ssDNA的結(jié)合過(guò)程，Tankyrase1調(diào)節(jié)TRF1與dsDNA的結(jié)合程度

3、與狀態(tài)。端?？s短過(guò)程涉及Tankyrase1對(duì)TRF1的作用；而端粒3'突出端縮短的過(guò)程則涉及TRF1與POT1。它們對(duì)于細(xì)胞復(fù)制性衰老起重要作用。雖然這些端粒相關(guān)因子與細(xì)胞衰老密切相關(guān)已經(jīng)被認(rèn)可，但是它們對(duì)端粒結(jié)構(gòu)及端粒長(zhǎng)度變化的作用多是通過(guò)以腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象而獲得的。對(duì)于在正常細(xì)胞復(fù)制性衰老過(guò)程中它們是如何發(fā)揮作用的以及在細(xì)胞復(fù)制性衰老過(guò)程中會(huì)發(fā)生何種變化等許多問(wèn)題還遠(yuǎn)沒(méi)有得到闡明。此外，端粒酶RNA組分(hTR)是端粒酶的重要組

4、成部分，正常細(xì)胞不具有端粒酶活性，但在正常細(xì)胞卻存在hTR，它對(duì)細(xì)胞復(fù)制性衰老起作用嗎?因此我們選用Tankyrase1、TRF1、POT1、hTR作為研究對(duì)象，研究它們與細(xì)胞復(fù)制性衰老之間的關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)分離培養(yǎng)獲得HEL細(xì)胞，按1：2分瓶傳代直至其衰老，計(jì)算每傳一代的PD值，累計(jì)算出最終PD為64。培養(yǎng)后期細(xì)胞輪廓變得不再鮮明，細(xì)胞變粗、變大、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒增多。細(xì)胞形態(tài)所發(fā)生的變化表明細(xì)胞衰老了。進(jìn)一

5、步從分子水平上對(duì)細(xì)胞衰老加以驗(yàn)證。培養(yǎng)后期細(xì)胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶表達(dá)量增加，端粒的長(zhǎng)度變短。p21WAF-1隨著細(xì)胞的PD增加蛋白表達(dá)量增加，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)后，p21WAF-1的蛋白表達(dá)量趨于一平臺(tái)。以上這些檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HEL細(xì)胞復(fù)制性衰老模型建立成功。 在成功建立細(xì)胞復(fù)制性衰老模型的基礎(chǔ)上，針對(duì)端粒相關(guān)因子TRF1、Tankyrase1、hTR和POT1的表達(dá)情況，以及POT1的剪接體2與剪接體5表達(dá)情況進(jìn)行了

6、研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞的衰老對(duì)TRF1的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響，而TRF1蛋白表達(dá)水平在細(xì)胞衰老早期隨細(xì)胞衰老逐漸升高，而后快速降低，表明TRF1的表達(dá)變化可能是引發(fā)細(xì)胞衰老的重要因子之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著細(xì)胞的衰老，Tankyrase1的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平并不隨細(xì)胞的衰老而變化，Tankyrase1對(duì)其底物TRF1聚腺苷二磷酸核糖基化水平的變化可能對(duì)人胚肺細(xì)胞的衰老更具有意義。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)POT1mRNA隨著人胚肺成纖維細(xì)胞的衰老表

7、達(dá)水平逐漸降低，由于POT1表達(dá)量的降低，影響POT1與端粒突出端ssDNA的結(jié)合能力，使POT1不足以與ssDNA結(jié)合，導(dǎo)致了端粒末端結(jié)構(gòu)的破壞，加速了細(xì)胞的衰老。通過(guò)檢測(cè)人胚肺成纖維細(xì)胞衰老過(guò)程中不同PD的HEL細(xì)胞hTR的RNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其mRNA水平隨著細(xì)胞的衰老呈遞增趨勢(shì)。表明hTR參與細(xì)胞的衰老過(guò)程，而且很有可能是通過(guò)非端粒酶途徑，與細(xì)胞內(nèi)其它蛋白相互作用而發(fā)揮作用。 在人胚肺細(xì)胞復(fù)制性衰老過(guò)程中，端粒相關(guān)因子發(fā)