酵母復(fù)制衰老細(xì)胞分選的方法研究.pdf

1、衰老是一種自然規(guī)律，是不可逆轉(zhuǎn)的生命進(jìn)程。細(xì)胞作為生物有機(jī)體的基本單位，也在不斷地新生和衰老死亡。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究細(xì)胞衰老機(jī)制的最有效常用的模式生物，其有很多優(yōu)勢(shì):易于培養(yǎng)，基因組較小，遺傳操作簡(jiǎn)單，存在很多與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似的保守生化機(jī)制。
　　 近年來轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法逐漸被應(yīng)用在酵母衰老研究中，能在全基因組水平考察基因表達(dá)譜。有人通過DNA芯片分析比較了復(fù)制壽命年輕的細(xì)胞和衰老細(xì)

2、胞mRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)隨著衰老，細(xì)胞新陳代謝由糖酵解途徑向糖異生途徑和能量?jī)?chǔ)存途徑轉(zhuǎn)變。但由于現(xiàn)有細(xì)胞分選技術(shù)的局限性，獲得的衰老細(xì)胞的復(fù)制壽命遠(yuǎn)低于野生型單倍體酵母中位壽命，因此阻礙酵母細(xì)胞衰老的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。
　　 本課題分析了現(xiàn)有的酵母復(fù)制壽命衰老細(xì)胞的分選方法（蔗糖梯度離心分選法和磁珠分選法），并結(jié)合微流控技術(shù)，優(yōu)化及設(shè)計(jì)了新的能獲得復(fù)制壽命接近平均壽命的酵母衰老細(xì)胞的分選方法。此項(xiàng)研究能解決復(fù)制壽命衰老細(xì)胞分選難題，為

3、后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)保障。
　　 此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，對(duì)酵母的正常生長無影響，過程中能做到同步顯微鏡觀察并實(shí)時(shí)圖片記錄酵母細(xì)胞生長并分裂產(chǎn)生后代細(xì)胞的全過程，能提供酵母細(xì)胞從年輕到衰老的過程的形態(tài)學(xué)及子細(xì)胞代增時(shí)間的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。并最終能獲得后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)（mRNA表達(dá)譜）所需要的能夠達(dá)到甚至超過巾位壽命的復(fù)制壽命衰老的細(xì)胞，推動(dòng)酵母衰老機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，為衰老的遺傳決定學(xué)說提供實(shí)驗(yàn)支持。此外，該分選系統(tǒng)還

4、提供了其它分選技術(shù)所不具備的額外功能——可在酵母細(xì)胞生長的任意階段即時(shí)加藥刺激，能夠?yàn)楦M(jìn)一步的藥物刺激實(shí)驗(yàn)提供靈活的用藥操作支持。
　　 本課題通過將酵母細(xì)胞固定在玻片表面，用流動(dòng)的培養(yǎng)基將新生的后代細(xì)胞帶走，從而實(shí)現(xiàn)子母細(xì)胞的分離，最終獲得后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析所需的復(fù)制壽命同步衰老的酵母細(xì)胞。本課題嘗試了三種酵母細(xì)胞固定方案:
　　 1）牛血清白蛋白-鏈霉親和素-生物素標(biāo)記的酵母;
　　 2）三維醛基基片-酵母細(xì)

5、胞;
　　 3）醛基基片-鏈霉親和素-生物素標(biāo)記的酵母細(xì)胞。
　　 結(jié)果顯示，三種固定方案都能成功的將酵母細(xì)胞連接到玻片表面，且能保持大部分細(xì)胞固定超過10小時(shí)不被沖走。
　　 方案一的連接效率較低、穩(wěn)固性差，但細(xì)胞生長分裂正常。
　　 方案二連接效率最高、穩(wěn)固性強(qiáng)，但細(xì)胞難以生長。
　　 方案三，連接效率較低，穩(wěn)固性高，細(xì)胞生長正常。
　　 綜合起來，方案三的固定方案優(yōu)勢(shì)明顯，初步試驗(yàn)中