釀酒酵母ARS側(cè)翼序列對(duì)其復(fù)制活性的影響.pdf

1、細(xì)胞在增殖過(guò)程中最重要過(guò)程的是其間期的DNA復(fù)制。他受到多方面的因素影響。其中其復(fù)制起點(diǎn)對(duì)其影響尤為重要,它的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致癌癥等多種疾病的產(chǎn)生。而酵母作為模式生物之一,它有著真核生物和原核生物雙重特點(diǎn),是作為研究復(fù)制起始位點(diǎn)的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)材料。酵母復(fù)制的起始位點(diǎn)稱為自主復(fù)制序列(ARS),其III號(hào)染色體上的ARS約有19個(gè),其使用頻率各不相同,通過(guò)高通量的核小體定位發(fā)現(xiàn),在ARS側(cè)翼上出現(xiàn)核小體的分布各有不同,由此可見ARS兩側(cè)序列可能

2、會(huì)影響ARS的活性。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增酵母III號(hào)染色體上的ARS304、ARS305及其側(cè)翼序列。并以整合型載體pRS405為基礎(chǔ)構(gòu)建重組質(zhì)粒PARS304,PARS304-500,PARS304-2000。為了鑒定ARS304、ARS305不同側(cè)翼序列對(duì)釀酒酵母的自主復(fù)制活性的影響,將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒以及本實(shí)驗(yàn)室原有保存的載體PARS305,PARS305-500,PARS305-2000通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)

3、胞。酵母感受態(tài)細(xì)胞為缺陷型細(xì)胞,pRS405載體上含有亮氨酸標(biāo)記但必須整合到酵母基因組上才能表達(dá),而由于搭載有ARS序列的載體可以游離于基因組之外獨(dú)立表達(dá)合成亮氨酸,所以通過(guò)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù),從而計(jì)算轉(zhuǎn)化頻率。在此過(guò)程中對(duì)電轉(zhuǎn)化進(jìn)行條件優(yōu)化,通過(guò)均勻設(shè)計(jì)對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度、外源DNA量和酵母生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)電轉(zhuǎn)化的影響。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度在1750V,酵母OD值在1.3,外源DNA量在600ng時(shí),轉(zhuǎn)化率最高。在此條件下測(cè)定質(zhì)粒丟失率。經(jīng)計(jì)算PARS304轉(zhuǎn)

4、化率為389-412轉(zhuǎn)化子/μg,質(zhì)粒每代的丟失率為16.2％;PARS305轉(zhuǎn)化率為523-551轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒,每代的丟失率為11.2%;PARS304-500轉(zhuǎn)化率為476-497轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒,每代的丟失率為14.7%;PARS305-500轉(zhuǎn)化率為723-734轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒;每代的丟失率為9.01%,PARS304-2000轉(zhuǎn)化率為623-632轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒,每代的丟失率為9.35%;PARS305-2000轉(zhuǎn)化率

5、為929-939轉(zhuǎn)化子/μg,質(zhì)粒每代的丟失率為8.1%。這說(shuō)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒在酵母中都是不穩(wěn)定的,都可以進(jìn)行自主復(fù)制。且ARS305及其側(cè)翼序列轉(zhuǎn)化率高于ARS304,隨著側(cè)翼序列的增長(zhǎng)其自主復(fù)制活性增高。
　　本實(shí)驗(yàn)后續(xù)工作在PARS-500,PARS-1000,PARS-2000。重組質(zhì)粒上組裝核小體,研究重組質(zhì)粒上核小體的分布及核小體定位對(duì)復(fù)制起始活性的影響,為以酵母作模式生物研究真核基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供了有益的線索。