血管平滑肌細(xì)胞復(fù)制衰老過程及其與BK-,Ca-相關(guān)機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：培養(yǎng)出不同年齡組血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，探討VSMCs年齡相關(guān)的衰老過程，進(jìn)而探討在BKCa活性改變時細(xì)胞衰老相關(guān)因子P16INK4a表達(dá)及細(xì)胞增殖，旨在揭示BKCa與VSMCs衰老關(guān)系。 方法：1．實(shí)驗(yàn)動物：健康雄性SD大鼠，年輕組與老年組各20只。2．細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定：①無菌操作下，取出主動脈，轉(zhuǎn)移至冷PBS，去血管外膜、內(nèi)膜，剪碎中膜成糊狀，0.2％Ⅱ型膠原酶溶液(20％FBS的DMEM/F12配制)消化，分離細(xì)

2、胞，在37℃、飽和濕度、5％CO2環(huán)境下，生長至90％-100％，胰酶與EDTA混合溶液消化，按比例1:3傳代；取對數(shù)生長期細(xì)胞(80％-90％融合)，離心，含10％DMSO凍存液重懸，約5×106/管加入凍存管，置液氮中凍存。需要復(fù)蘇時，首先將凍存管從液氮中取出，迅速復(fù)溫，用新鮮配置培養(yǎng)基稀釋，離心、重懸、吸入培養(yǎng)瓶，37℃CO2孵箱孵育。②鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定平滑肌細(xì)胞α-actin。3．對VSMCs做細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(

3、SA-β-gal)染色：制備老年組、年輕組的第2、6、11代細(xì)胞爬片，用SA-β-gal工作液染色，顯微鏡下計數(shù)藍(lán)染陽性細(xì)胞，計算衰老細(xì)胞率。4．MTT測定的不同濃度BKCa開放劑、阻斷劑組及開放劑媒介組培養(yǎng)24h、48h、72h在波長為490nm下吸光度，計算抑制率及促進(jìn)率，確定藥物干預(yù)濃度。5．免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測P16INK4a表達(dá)：青年組與老年組VSMCs 4％多聚甲醛固定；0.3％ TritonX-100透細(xì)胞處理后，與抗p1

4、6INK4a抗體4℃孵育過夜，與二抗室溫孵育30min，DAB顯色，倒置顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞。6．統(tǒng)計分析：計數(shù)資料用Fisher's確切概率法檢驗(yàn)。計量資料均經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用方差分析，多樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)或Tamhane t檢驗(yàn)。P<0.05或P<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1．血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定①形態(tài)學(xué)：倒置顯微鏡下，細(xì)胞形態(tài)為長梭形，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞典型的“峰谷”樣生長。②免疫細(xì)胞化

5、學(xué)染色：胞漿內(nèi)黃染，細(xì)胞純度在95％以上。③不同年齡組血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)成功率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。2．細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色：衰老細(xì)胞細(xì)胞變大、變得不規(guī)則；β-半乳糖苷酶染色胞漿呈深藍(lán)色。衰老細(xì)胞數(shù)量隨代齡增加而增加(P<0.05)；第6、11代齡，老年組衰老細(xì)胞陽性率較年輕組高。3．MTT檢測細(xì)胞增殖活性：①NS1619媒介組與NS1619空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示可以使用助溶劑DMSO以終濃度體積比0.3％配制NS1619

6、，對細(xì)胞的生長影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。②IBTX在一定范圍以時間、濃度依賴方式抑制VSMCs增殖，同時有濃度飽和現(xiàn)象。③NS1619以時間、濃度依賴方式促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖。4．BKCa活性對VSMCs中P16INK4a表達(dá)的影響①阻斷BKCa：陽性細(xì)胞胞質(zhì)深黃染；無論老年組還是年輕組大鼠VSMCs P16INK4a表達(dá)陽性率增加，老年組較年輕組P16INK4a表達(dá)增加明顯。②NS1619作用后，青年組與其對照組相比較P16INK4a表達(dá)無統(tǒng)

7、計學(xué)意義；老年組與起對照組比較P16INK4a表達(dá)呈下降趨勢，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義；老年組相對于青年組無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：1．Ⅱ型膠原酶消化法可以成功培養(yǎng)出不同年齡組大鼠主動脈VSMCs，為研究老年動物體外培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性及血管老化及相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。2．我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的VSMCs，在本質(zhì)上就深深烙上年齡因素的印跡，后者直接影響細(xì)胞的增殖潛能與衰老，這也許能為研究體內(nèi)非增殖細(xì)胞的衰老與血管老化及相關(guān)疾病提供新的思路。3．