人芽囊原蟲純培養(yǎng)的建立及SD大鼠感染模型Th1-Th2細(xì)胞因子表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的:探討碘染色法與改良培養(yǎng)法在人芽囊原蟲(B.h)檢出中的應(yīng)用，并以此獲得蟲株后建立B.h純培養(yǎng)體系，進(jìn)而采用純培養(yǎng)蟲株建立SD大鼠感染模型，動態(tài)研究B.h感染大鼠的Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)。
　　方法:比較普通培養(yǎng)法和改良培養(yǎng)法的最低檢出限、生長曲線及厭氧環(huán)境形成時間;從廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院門診檢驗科收取397份糞便樣本，采用碘染色法和改良培養(yǎng)法對樣本進(jìn)行檢測，對陽性標(biāo)本采用碘染色法和三色染色法進(jìn)行染色觀察，比較陽性檢出率，

2、以改良培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，計算碘染色法的靈敏度、特異度、一致率和kappa值，采用PCR方法進(jìn)行基因分型;采用LES培養(yǎng)基進(jìn)行帶菌培養(yǎng)，聯(lián)合使用青霉素(1000U/ml)、鏈霉素（1000ug/ml）、兩性霉素B(2.5 ug/ml)、磷霉素（20ug/ml）、阿莫西林-克拉維酸鉀混懸液（31.25ug/ml）、氯霉素（20ug/ml）等6種抗生素進(jìn)行無菌純培養(yǎng)，使用雞蛋上清液-馬血清-Bacto agar混合瓊脂平板，進(jìn)行單克隆試驗;獲取

3、純培養(yǎng)蟲株后，取30只SD大鼠，分5組，每組6只，經(jīng)地塞米松免疫抑制后，實驗組經(jīng)口感染107/只，對照組經(jīng)口灌食等量滅菌PBS，分別于0d、3d、6d、9d和14d處死大鼠取材，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的表達(dá)水平，比色法檢測結(jié)腸組織中髓過氧化物酶(MPO)的含量，HE染色觀察結(jié)腸組織病理損傷，熒光定量PCR檢測結(jié)腸中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10 mRNA的表

4、達(dá)水平。
　　結(jié)果:改良培養(yǎng)法的最低檢出限低于普通培養(yǎng)法，改良培養(yǎng)法在B.h的密度在前3天高于普通培養(yǎng)法;在糞便及短期培養(yǎng)的標(biāo)本中，可觀察到空泡型和顆粒型，在糞便標(biāo)本中可以觀察到包囊;碘染色法的陽性率為1.01％，改良培養(yǎng)法的陽性率為5.54％，兩者的陽性率差別有統(tǒng)計學(xué)意義;以改良培養(yǎng)法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，碘染色法的靈敏度為18.18％，特異度為100％，一致率為95.47％，kappa值為29.57％;帶菌培養(yǎng)和純培養(yǎng)的B.h均以空泡

5、型為主，帶菌培養(yǎng)和純培養(yǎng)的密度到達(dá)峰值的時間基本相同，但是帶菌培養(yǎng)的密度下降很快，純培養(yǎng)的密度下降緩慢，維持較高的密度;在雞蛋上清液-馬血清-Bacto agar混合瓊脂平板表面可觀察到“菌落狀”白色圓點，倒置顯微鏡下可看到大量空泡型蟲體;感染大鼠與對照組的結(jié)腸病理評分為0分，感染大鼠結(jié)腸的MPO含量與對照組相比無顯著改變;感染大鼠血清中IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平與對照組相比無顯著改變，14d組大鼠血清中TNF-α與對照組相比較有顯

6、著改變，3d組(P=0.003)、6d組(P=0.013)、9d組(P=0.004)、14d組(P=0.000)大鼠血清中的IL-10與對照組相比較均有統(tǒng)計學(xué)意義;各組結(jié)腸中細(xì)胞因子IFN-γ mRNA表達(dá)比較具有統(tǒng)計學(xué)差異，其中3d組、6d組和14d組與對照組相比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義;各組大鼠結(jié)腸中的TNF-αmRNA比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，但組間兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)意義;各組結(jié)腸中細(xì)胞因子IL-4 mRNA表達(dá)比較具有統(tǒng)計學(xué)差異，其中6d組