馬立克氏病meq基因轉(zhuǎn)染CEF后部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和錯配修復(fù)基因的研究.pdf

1、雞馬立克氏病(Marek's Disease，MD)是一種由血清型Ⅰ型馬立克氏病毒(Marek's DiseaseⅥrus，MDV)引起的T淋巴細(xì)胞腫瘤性疾病，具有高度的傳染性。MDV是唯一已知能急性轉(zhuǎn)化的α皰疹病毒。MDV不僅可引起患雞內(nèi)臟T細(xì)胞淋巴瘤、癱瘓、失明和神經(jīng)功能障礙，而且還可以引起較強(qiáng)的免疫抑制。微衛(wèi)星(Microsatellite，MS)是一個位點特異的DNA序列，它們的核苷酸序列較短（重復(fù)單元為1-6個堿基對），核苷酸

2、序列串聯(lián)重復(fù)10-60次，其側(cè)翼為獨特的序列。在生物體基因組中，微衛(wèi)星是有高豐度的特異性DNA標(biāo)記。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)是由于復(fù)制錯誤（replication error，RER）引起的微衛(wèi)星等位基因的增加或丟失，造成微衛(wèi)星DNA長度發(fā)生改變，表現(xiàn)為(CA)n雙核苷酸電泳遷移率的改變，出現(xiàn)與正常基因長度不同的等位基因條帶。錯配修復(fù)基因(Mismatch Repair，MMR)是切

3、除修復(fù)未成對或錯配的堿基并通過替換正確的DNA堿基對的一組基因。本試驗對馬立克氏病meq基因轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)后部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和錯配修復(fù)基因表達(dá)情況進(jìn)行研究。研究目的是為馬立克氏病meq基因的致瘤機(jī)制提供線索，試驗分為以下三部分。
　　第一部分是pVAX-1-meq真核表達(dá)載體的構(gòu)建和在雞胚成纖維細(xì)胞中表達(dá)驗證。采用TA克隆將MEQ基因片段連接pMD19-T Vector構(gòu)建出pMD19-T-meq質(zhì)粒，pMD19-

4、T-meq質(zhì)粒和pVAX-1真核表達(dá)質(zhì)粒采用EcorRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，將meq基因ORF克隆至pVAX-1質(zhì)粒中，構(gòu)建pVAX-1-meq真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆采用pVAX-1質(zhì)粒通用引物T7 primer和BGH reverse primer進(jìn)行PCR驗證和EcorRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切驗證。將pVAX-1-meq真核表達(dá)質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至雞胚成纖維細(xì)胞，并分別在轉(zhuǎn)染后的24 h

5、、48 h、72 h提取貼壁細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)meq基因mRNA設(shè)計引物MEQ mRNA F/R，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，檢測出meq基因mRNA成功在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。比較正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)染meq基因的細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期的指標(biāo)。轉(zhuǎn)染meq基因后細(xì)胞凋亡率并未明顯改變，細(xì)胞周期失控，G2期和S期阻滯，DNA復(fù)制過程受阻，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性降低，說明轉(zhuǎn)染MEQ基因至CEF細(xì)胞后并

6、未使得CEF細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，但會引起CEF的DNA合成受阻。
　　試驗第二部分是把構(gòu)建好的pVAX-1-meq真核表達(dá)質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至雞胚成纖維細(xì)胞，同時設(shè)置空載體對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組，并分別在轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h提取貼壁細(xì)胞總DNA;選取本實驗室前期初步篩選的馬立克氏病腫瘤中變化頻率較高的微衛(wèi)星標(biāo)記，以此微衛(wèi)星位點設(shè)計了46對引物，以提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)

7、定性，根據(jù)銀染后的結(jié)果來看，并未發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組有明顯的微衛(wèi)星條帶差異。
　　試驗第三部分是把構(gòu)建好的pVAX-1-meq真核表達(dá)質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至雞胚成纖維細(xì)胞，同時設(shè)置空載體對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組，并分別在轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，檢測錯配修復(fù)相關(guān)基因MLH1，MSH2和PMS1的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染meq基因后24h，錯配修復(fù)基因MLH1