活性鹵酚對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其與HO-1蛋白的相關(guān)性.pdf

1、研究背景：
　　課題組前期針對天然來源的鹵酚進(jìn)行了連續(xù)的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，已經(jīng)設(shè)計(jì)合成了二苯甲酮、二苯甲烷、苯基呋喃-2-基甲酮、苯基噻吩-2-基甲酮四種骨架類型的鹵酚化合物，通過活性的系統(tǒng)篩選，獲得了多個(gè)體外具有高活性的新型鹵酚化合物。其中，對氧化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高保護(hù)活性的是2,4’,5’-三羥基-5,2’-二溴二苯甲酮（LM49）、4,5-二羥基2,3-二溴二苯甲酮（LM48）和3，4-二羥基-3’-氯二苯甲酮（LM46

2、），其EC50分別為0.4μmol/L，0.8μmol/L和5.0μmol/L。通過進(jìn)一步的在體研究，表明這3個(gè)化合物都具有顯著的對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，且藥理活性最好的的是LM49，其次是LM48和LM46。此外，初步的作用機(jī)制研究已經(jīng)證實(shí)HO-1是鹵酚保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白。
　　目的：
　　明確活性鹵酚LM46、LM48和LM49對Na2S2O4致H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并探討HO-1蛋

3、白與該保護(hù)作用的相關(guān)性。
　　方法：
　　1. Na2S2O4氧耗法建立H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。
　　2.采用MTT法檢測細(xì)胞相對活力，流式細(xì)胞儀檢測ROS和凋亡，試劑盒檢測LDH，MDA，SOD，CK，明確活性鹵酚對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　3.采用Western blot和PCR法檢測活性鹵酚對HO-1的蛋白和基因表達(dá)的影響。
　　4.采用特異性阻斷劑ZnPP阻斷HO-1，MTT法檢測細(xì)胞活力

4、，活性熒光定量試
　　劑盒檢測HO-1活性，明確鹵酚化合物對心肌細(xì)胞保護(hù)作用與關(guān)鍵蛋白HO-1的相關(guān)性。
　　5.探討活性鹵酚對HO-1的誘導(dǎo)是否依賴于新HO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄，在加入活性鹵酚之前加入mRNA合成抑制劑actinomycinD（ActD），western檢測HO-1蛋白的表達(dá)。探討活性鹵酚對HO-1的誘導(dǎo)是否依賴于新蛋白的合成，在加入鹵酚化合物之前加入蛋白合成抑制劑cycloheximide（CHX），PCR

5、檢測HO-1mRNA的表達(dá)。
　　6.熒光光譜法研究鹵酚化合物和HO-1蛋白的相互作用，探討它們的相互作用是否和前面的細(xì)胞保護(hù)活性及對HO-1基因水平的誘導(dǎo)順序一致。
　　結(jié)果：
　　1. LM46、LM48和LM49在設(shè)定劑量2.5，5和10μmol/L范圍內(nèi)可劑量依賴性地提高細(xì)胞相對活力，降低細(xì)胞凋亡率和ROS水平，升高SOD活力，抑制LDH、CK、MDA釋放，且對心肌細(xì)胞的保護(hù)活性順序?yàn)長M49>LM48>LM4

6、6。
　　2.三個(gè)鹵酚化合物均可顯著誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)及升高mRNA水平，并呈量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，而且對 HO-1蛋白和基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用順序?yàn)長M49>LM48>LM46。
　　3.三個(gè)鹵酚化合物均可劑量依賴性的提高心肌細(xì)胞HO-1的活性，其誘導(dǎo)順序?yàn)長M49>LM48>LM46；采用 ZnPP阻斷后，給藥組的 HO-1活性及細(xì)胞保護(hù)率均顯著降低。
　　4.加入轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD后，三個(gè)鹵酚化合物對HO-1蛋白表達(dá)

7、的誘導(dǎo)均較單獨(dú)給藥顯著降低；加入蛋白合成抑制劑CHX后，三個(gè)鹵酚化合物給藥組的HO-1 mRNA水平均較單獨(dú)給藥組升高。
　　5.三個(gè)鹵酚化合物均能使HO-1的熒光光譜猝滅，猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，結(jié)合常數(shù)相差不大。從熱力學(xué)參數(shù)判斷，LM46與HO-1間相互作用力主要為范德華力、氫鍵或質(zhì)子化等作用力；LM48和LM49與HO-1間相互作用力主要為靜電作用和疏水作用力。隨著鹵酚LM48，LM49濃度的增加，同步熒光光譜色氨酸的最大發(fā)射波

8、長略有紅移，顯示 HO-1色氨酸殘基附近的微環(huán)境疏水性降低，極性增強(qiáng)。結(jié)合三維光譜等高線圖，可以推斷在鹵酚化合物存在下HO-1的構(gòu)象發(fā)生了變化。
　　結(jié)論：
　　1.活性鹵酚對缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞有明確的保護(hù)作用，該保護(hù)作用與抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)，活性順序?yàn)長M49>LM48>LM46。
　　2. HO-1是活性鹵酚保護(hù)心肌細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，活性鹵酚可通過誘導(dǎo)HO-1的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，升高HO-1蛋白表達(dá)，提高