PI3K-nos2b參與模擬微重力調(diào)控斑馬魚血管發(fā)育過程的研究.pdf

1、隨著世界航天事業(yè)的快速發(fā)展，人類在外太空的活動周期越來越長，近年來研究顯示，長期處于微重力環(huán)境下，會引起宇航員心血管系統(tǒng)局部異常，血管新生及重構(gòu)，導(dǎo)致多種心血管疾病的發(fā)生。并且微重力可以通過調(diào)控細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能進而影響心血管系統(tǒng)發(fā)育。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注微重力對心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響，相繼報導(dǎo)了一些相關(guān)的信號調(diào)控途徑，但是微重力究竟是通過改變哪些關(guān)鍵的分子信號，影響心血管發(fā)育？還不是很明確，需要更進一步闡述。本文采用中科院力學

2、研究所研制的MG-IIA型地基微重力模擬器，以綠色熒光標記血管內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎（Flk1: GFP）作為地面模擬微重力效應(yīng)的研究模型，通過對斑馬魚胚胎的旋轉(zhuǎn)進行模擬微重力（simulated microgravity, SM）處理，在體實時的觀察模擬微重力對斑馬魚血管發(fā)育的影響，并對其分子機制進行初步的探索。
　　本研究主要內(nèi)容包括：①模擬微重力對斑馬魚胚胎血管發(fā)育的影響。斑馬魚胚胎受精后12hpf（hour post-

3、fertilization）時進行SM處理，分別處理至24hpf和36hpf，對照組在1G條件下正常培養(yǎng)，SM組在MG-IIA型地面微重力模擬器中培養(yǎng)。通過體式顯微鏡統(tǒng)計斑馬魚胚胎的存活率、心率的情況。熒光拍照、qPCR以及原位雜交實驗觀察對照組與SM組斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況。實驗結(jié)果表明，SM對斑馬魚的存活率沒有影響，但是卻顯著降低斑馬魚心率，并且在微重力處理至36hpf時明顯影響了斑馬魚胚胎的血管發(fā)育，導(dǎo)致局部血管發(fā)育異常，尾部靜脈

4、叢發(fā)育速率加快，促進血管新生及重構(gòu)，血管網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度提高。說明SM會影響斑馬魚血管發(fā)育過程。②nos2b參與模擬微重力對斑馬魚胚胎血管發(fā)育過程。首先通過對SM處理后的36hpf斑馬魚胚胎總蛋白中NO含量的測定，結(jié)果表明，微重力處理過后斑馬魚胚胎總蛋白中NO的含量相對于對照組來說有明顯的增加。初步判斷NO信號參與到微重力對斑馬魚胚胎血管發(fā)育過程。之后再分別注射nos2b MO和注射nos2b MO與微重力共處理，至36hpf觀察血管發(fā)育情

5、況。實驗結(jié)果顯示，nos2b基因被敲降以后，微重力引起的斑馬魚血管新生會有一定的回救，說明nos2b參與到了微重力調(diào)節(jié)斑馬魚血管發(fā)育過程。③PI3K參與斑馬魚胚胎血管發(fā)育過程。在實驗中我們采用PI3K的特異性抑制劑LY294002處理斑馬魚胚胎至36hpf，結(jié)果表明，與對照組相比，用抑制劑處理過后的斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況明顯受到抑制，節(jié)間血管發(fā)育紊亂、尾部靜脈叢有破裂；PI3K參與模擬微重力調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎血管發(fā)育過程。實驗分為三組，分別

6、為對照組，模擬微重力至36hpf、模擬微重力至36hpf和LY294002共處理，從表型、qPCR以及全胚原位雜交的結(jié)果中可以看出，用PI3K抑制劑處理過后，微重力引起血管異常新生作用會得到部分回救，證明PI3 K確實參與到了模擬微重力對斑馬魚血管發(fā)育的過程；PI3K-nos2b信號通路參與模擬微重力調(diào)控斑馬魚血管發(fā)育的過程。分別注射nos2bmRNA和注射nos2b mRNA與PI3K的特異性抑制劑LY294002共處理，通過表型、q