MiR-144靶向調(diào)控meis1表達(dá)在斑馬魚(yú)胚胎期造血及血管發(fā)育中的功能研究.pdf

1、目前，血液病與心血管疾病已是危害人類健康的重大問(wèn)題，給國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)不可估量的損失。我國(guó)至少有400萬(wàn)白血病患者，每年新增約4萬(wàn)名白血病患者，其中50％是兒童。心血管病患者人數(shù)約為2.3億，相當(dāng)于每10個(gè)成年人中有2人患有心血管疾病。因此，揭示造血及心血管發(fā)育的分子機(jī)制及其相關(guān)疾病的發(fā)病的機(jī)理，建立新的防治策略和治療方案是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域急需解決的重大基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題。目前，研究者面臨的最大挑戰(zhàn)就是尋找更多造血及心血管發(fā)育具有調(diào)控功能的治療

2、靶分子和信號(hào)途徑。
　　MicroRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源的、長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼微小RNA，廣泛存在于真核生物中，具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。miR-144是在造血組織及血液中特異表達(dá)的一個(gè)miRNA，已報(bào)道m(xù)iR-144在白血病患者表達(dá)顯著降低，并且在腫瘤發(fā)生、血紅蛋白合成中發(fā)揮重要作用。但miR-144在造血與血管發(fā)育中的功能作用仍不清楚。本研究以模式生物斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析方法、顯微注

3、射、整體原位雜交以及拯救實(shí)驗(yàn)技術(shù)，揭示miR-144在斑馬魚(yú)胚胎造血及血管發(fā)育過(guò)程的生物學(xué)功能，闡明miR-144介導(dǎo)的血細(xì)胞發(fā)育及血管發(fā)育的分子機(jī)制。首先，應(yīng)用多個(gè)在線生物信息學(xué)軟件全面預(yù)測(cè)分析miR-144靶向調(diào)控潛在靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)包括meis1在內(nèi)的三十多個(gè)基因可能是miR-144的潛在靶標(biāo)。通過(guò)體內(nèi)外報(bào)告基因質(zhì)粒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-144直接靶向調(diào)控meis1表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)顯微注射在斑馬魚(yú)胚胎過(guò)表達(dá)miR-144，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎MEI

4、S1表達(dá)顯著降低。從而說(shuō)明在斑馬魚(yú)胚胎中miR-144通過(guò)直接靶向調(diào)控meis1表達(dá)(P<0.05)。Meis1是三氨基酸環(huán)延伸家族一員，是同源基因hoxa9和pbx1的輔助因子。已有大量研究表明meis1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分化、造血、眼睛發(fā)育等有舉足輕重的作用，并且與白血病發(fā)生相關(guān)。接下來(lái)深入探究miR-144介導(dǎo)meis1表達(dá)在斑馬魚(yú)胚胎造血及血管發(fā)育中的功能作用。
　　其次，應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-144阻滯胚胎中包括

5、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在內(nèi)髓系細(xì)胞的發(fā)育。經(jīng)整體原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，髓系血細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵基因(scl、gata2和pu.1)和造血干細(xì)胞標(biāo)記基因(c-myb,runx1)表達(dá)降低。緊接著通過(guò)顯微共注射meis1基因mRNA的拯救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)meis1可明顯恢復(fù)scl、pu.1、c-myb和runx1基因表達(dá)，同時(shí)回補(bǔ)了胚胎粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的生成。從此說(shuō)明miR-144介導(dǎo)meis1表達(dá)調(diào)控斑馬魚(yú)胚胎髓細(xì)胞發(fā)育。
　　第三，經(jīng)O染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

6、過(guò)表達(dá)miR-144顯著降低胚胎紅細(xì)胞生成，同時(shí)經(jīng)原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因scl、gata1、cmyb以及runx1在高表達(dá)miR-144的胚胎中表達(dá)式顯著降低，但通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用meis1基因mRNA不能很好恢復(fù)胚胎紅細(xì)胞生成，而是采用meis1基因和gata1基因mRNA共同注射才能恢復(fù)胚胎紅細(xì)胞生成。綜合相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)miR-144/451基因簇協(xié)調(diào)表達(dá)調(diào)控胚胎紅細(xì)胞發(fā)育。
　　最后，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(flk1)

7、研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-144顯著影響胚胎內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育，胚胎節(jié)間血管(ISV)生成嚴(yán)重受阻，且在DA區(qū)熒光強(qiáng)度也有所降低。進(jìn)一步經(jīng)原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-144顯著降低動(dòng)脈標(biāo)記基因(ephrinB2)表達(dá)，而靜脈發(fā)育標(biāo)記基因(flt4、ephB4)未見(jiàn)明顯變化。通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)meis1基因mRNA可以恢復(fù)胚胎節(jié)間血管(ISV)和動(dòng)脈發(fā)育。從而說(shuō)明miR-144介導(dǎo)meis1表達(dá)在斑馬魚(yú)胚胎血管發(fā)育中有著重要的生物學(xué)功能。本研究的完