顯微捕獲聯(lián)合低體積擴(kuò)增細(xì)胞標(biāo)識與法醫(yī)應(yīng)用的研究.pdf

1、目的:
　　 顯微捕獲聯(lián)合低體積擴(kuò)增(Low volume polymerase chain reaction,LVPCR)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分離檢驗(yàn)為法醫(yī)混合微量生物檢材的檢驗(yàn)提供了有效途徑,但法醫(yī)實(shí)踐檢案的檢材細(xì)胞質(zhì)量良莠不齊,又含雜質(zhì)干擾等,致使鏡下目的細(xì)胞的辨識成為檢驗(yàn)結(jié)果好壞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究基于顯微捕獲儀平臺,應(yīng)用組織學(xué)染色的原理,初步建立一種適用于顯微捕獲聯(lián)合LVPCR的細(xì)胞標(biāo)識方法,并評價(jià)在法醫(yī)實(shí)際應(yīng)用的效果。

2、r>　　 方法:
　　 取10名志愿者的口腔拭子及2個案例檢材為樣本,制作細(xì)胞懸液;配制0.05g/ml龍膽紫及2.5×104 g/ml亞甲基藍(lán)染液。通過濃度梯度及時間梯度染色,分別建立并優(yōu)化以龍膽紫、蘇木素、亞甲基藍(lán)為標(biāo)識物的細(xì)胞懸液單染法;基于顯微捕獲儀平臺,分別對等量染色的口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行分離檢驗(yàn),比較3種染色法及染色時間對顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù)檢測結(jié)果的影響,優(yōu)化細(xì)胞標(biāo)識物;應(yīng)用3者中較優(yōu)的染色法對志愿者口腔上皮細(xì)

3、胞懸液染色,捕獲不同樣本等量染色及未染色細(xì)胞分離檢驗(yàn),并對同一樣本重復(fù)該操作20次,比較2種條件下檢測結(jié)果成功分型率的差異,評價(jià)該染色法在顯微捕獲聯(lián)合LVPCR技術(shù)中的適用性;應(yīng)用于案例檢材的細(xì)胞分離檢驗(yàn),初步研究所建細(xì)胞標(biāo)識法的應(yīng)用效果。
　　 結(jié)果:
　　 室溫條件下,100μl細(xì)胞懸液加入0.5μl0.05g/ml龍膽紫染液,染色5min,胞核呈紫紅色,與胞漿對比明顯,染色效果不隨染色時間(≤60min)延長而明顯

4、變化。優(yōu)化后的3種細(xì)胞懸液單染法均能對口腔上皮細(xì)胞胞核清晰標(biāo)識,但龍膽紫染色細(xì)胞的分離檢驗(yàn)的成功分型率及有效分型率均高于另外兩種染色法,且染色時間(≤60min)對DNA檢測結(jié)果無明顯影響;而與未染色等量細(xì)胞分離檢驗(yàn)結(jié)果比較,不同樣本及同一樣本多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的成功分型率無明顯差異(p＞0.05)。案例檢材應(yīng)用,目的細(xì)胞標(biāo)識清楚,較未染色時易于辨識,捕獲到更多目的細(xì)胞,多次分離檢驗(yàn)結(jié)果疊加復(fù)合達(dá)同一認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)論: