聯(lián)合激光捕獲顯微切割與基因芯片研究低惡性膀胱移行上皮癌基因表達(dá)譜和生物通路.pdf

1、目的：膀胱癌是我國最常見的泌尿腫瘤。近年來研究發(fā)現(xiàn)，膀胱移行細(xì)胞癌從生物學(xué)行為到病理形態(tài)可分成低惡性與高惡性膀胱移行細(xì)胞癌兩種類型(常被稱之為兩類癌)。兩類癌概念的提出為人們從分子與基因水平對膀胱移行細(xì)胞癌進(jìn)行分類與研究提供了新的視角，并為闡明其發(fā)病機(jī)制與指導(dǎo)治療，以及推測預(yù)后提供了更具科學(xué)性的依據(jù)，具有重要的理論與現(xiàn)實意義。因此，本研究即是在其指引下，尋找其差異表達(dá)基因，探究低惡性膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而揭示其發(fā)病規(guī)律。同時，這

2、也正是膀胱癌研究領(lǐng)域亟待解決的難題之一。 目前國內(nèi)外研究基因表達(dá)差異的方法很多，主要有ESTs測序、SAGE、差減克隆、RNA差異顯示技術(shù)、RAD、抑制消減雜交技術(shù)等。但因特異性差，篩選陽性率低，故進(jìn)展較慢。而基因芯片雜交技術(shù)可同時監(jiān)測大量mRNA的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測出極其微量的mRNA，為差異表達(dá)基因篩選提供了最強(qiáng)有力的工具。迄今為止，雖然國際上已經(jīng)有幾項膀胱癌基因表達(dá)譜的芯片研究，但是多局限于高惡性膀胱癌，對于低惡性膀胱癌

3、研究較少。一個重要的原因就是：這類膀胱腫瘤一般不作膀胱全切而采用電切，獲得的腫瘤與癌旁組織樣本量少，難以提取到足夠量的RNA進(jìn)行表達(dá)譜芯片。另外，絕大多數(shù)膀胱癌芯片所采用的組織標(biāo)本未經(jīng)過顯微切割分離純化，直接影響了所得結(jié)論的可信度。激光捕獲顯微切割(LCM)是國際上最新型的微量組織分離技術(shù)，能在顯微鏡下利用激光從組織切片中捕獲并切割單一類型細(xì)胞群或單個細(xì)胞，可有效獲取特定組織細(xì)胞的RNA。但是，由于LCM捕獲細(xì)胞的數(shù)量有限，所得到的總R

4、NA的量難以滿足芯片檢測的要求，需要結(jié)合RNA的線性擴(kuò)增技術(shù)，在保持原來mRNA豐度不變的基礎(chǔ)上，對mRNA進(jìn)行線性放大，以滿足芯片研究mRNA的起始量要求，因此，近年來被引入顯微切割樣本的基因表達(dá)譜分析。 本研究在天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目(043114211)和天津醫(yī)科大學(xué)2003級博士創(chuàng)新基金(200505)資助下，采用Agilent公司開發(fā)的22K人類全基因組寡核苷酸表達(dá)譜芯片G4110B，結(jié)合激光捕獲顯微切割、RNA線

5、性擴(kuò)增等技術(shù)構(gòu)建了低惡性膀胱癌全基因組表達(dá)圖譜，初步篩選出了與低惡性膀胱癌發(fā)病相關(guān)的候選差異表達(dá)基因并結(jié)合功能聚類分析工具PathwayExplorer和GenMAPP初步描繪了低惡性膀胱移行細(xì)胞癌相關(guān)的生物通路。 方法：1.篩選低惡性膀胱癌發(fā)病相關(guān)的差異表達(dá)基因：采用Agilent人全基因組表達(dá)譜芯片G4110B，結(jié)合激光捕獲顯微切割、RNA線性擴(kuò)增等技術(shù)構(gòu)建低惡性膀胱移形細(xì)胞癌全基因組表達(dá)圖譜，進(jìn)而篩選出了與低惡性膀胱癌發(fā)病

6、相關(guān)的候選差異表達(dá)基因。 2.生物信息學(xué)分析和半定量RT-PCR驗證本實驗LCM標(biāo)本芯片結(jié)果的可靠性：為了驗證本實驗LCM標(biāo)本芯片結(jié)果的可靠性，將實驗結(jié)果與目前已經(jīng)證實的膀胱癌及腫瘤差異表達(dá)基因進(jìn)行比較，同時選擇4個差異表達(dá)基因進(jìn)行半定量RT-PCR驗證。 3.應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究EZH2和BMI-1蛋白在膀胱癌不同組織學(xué)類型、不同惡性程度等方面的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料，進(jìn)一步探討這兩個基因與膀胱癌的關(guān)系及臨床意義，并對這

7、兩種基因在膀胱癌中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行討論。 4.基因功能聚類和生物通路分析：聯(lián)合應(yīng)用功能聚類工具PathwayExplorer和GenMAPP分析基因芯片獲得的差異表達(dá)基因譜，描繪低惡性膀胱癌相關(guān)的生物通路，為低惡性膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、診斷和治療研究提供線索。 結(jié)果：1.差異基因表達(dá)譜結(jié)果：芯片數(shù)據(jù)分析獲得215個共同上調(diào)基因和53個共同下調(diào)基因，其中部分結(jié)果為膀胱癌或其他腫瘤中的已知差異表達(dá)基因，初步證明了LCM樣

8、本芯片結(jié)果的可靠性。 2.生物信息學(xué)分析和半定量RT-PCR驗證芯片結(jié)果：其中部分結(jié)果為膀胱癌或其他腫瘤中的已知差異表達(dá)基因，初步證明了LCM樣本芯片結(jié)果的可靠性；10例低惡性膀胱移形細(xì)胞癌與對用的正常膀胱粘膜組織標(biāo)本中，SPARCL-1，EZH2，BMI-1和IGFBP2mRNA差異表達(dá)，進(jìn)一步證實了基因芯片檢測結(jié)果的可靠性。 3.應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究了EZH2和BMI-1在膀胱癌組織中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果顯示：EZ

9、H2和BMI-1在膀胱癌中表達(dá)陽性率明顯高于正常膀胱粘膜中的表達(dá)陽性率，差異均有顯著意義(P＜0.05)。膀胱癌組織中EZH2的陽性表達(dá)隨著腫瘤病理分級的升高而增加(P＜0.05)，而與浸潤深度、復(fù)發(fā)與否、腫瘤大小均不具相關(guān)性(P＞0.05)。BMI-1的表達(dá)與膀胱癌復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P=0.032)，復(fù)發(fā)的膀胱癌患者多見BMI-1表達(dá)陽性，提示BMI-1的表達(dá)與膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。而BMI-1的表達(dá)與浸潤深度、病理分級、腫瘤大小均不具相關(guān)性

10、(P＞0.05)。 4.基因功能聚類和生物通路分析結(jié)果：運(yùn)用PathwayExplorer和GenMAPP程序在整個生物通路系統(tǒng)水平上對上述差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類，結(jié)果顯示：這些基因主要?dú)w屬于下列生物通路：WNT信號通路、MAPK信號通路、聚合粘附(Focaladhesion)、細(xì)胞增殖、泛素-蛋白酶體降解通路(Ubiquitinmediatedproteolysis)、緊密連接(tightjunction)、鈣信號通路、細(xì)胞

11、周期調(diào)控等，這些通路很可能在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。 結(jié)論：1.本研究在國內(nèi)首次聯(lián)合應(yīng)用激光捕獲顯微切割與基因芯片技術(shù)成功構(gòu)建了膀胱癌差異表達(dá)基因譜。在低惡性膀胱移行細(xì)胞癌與相應(yīng)正常膀胱粘膜之間篩選出268條差異表達(dá)基因，其中包括215個共同上調(diào)基因和53個共同下調(diào)基因，說明膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多基因表達(dá)異常，這些差異表達(dá)基因為膀胱癌分子機(jī)制研究提供了大量有價值的信息。 2.對差異表達(dá)基因譜的生物信息學(xué)

12、分析發(fā)現(xiàn)部分差異基因為膀胱癌或其他腫瘤中的已知差異表達(dá)基因，初步證明了LCM樣本芯片結(jié)果的可靠性；從中隨機(jī)挑取的4個差異基因SPARCL-1，EZH2，BMI-1和IGFBP2mRNA進(jìn)行經(jīng)典的RT-PCR檢測，結(jié)果顯示與正常膀胱粘膜比較，SPARCL-1，BMI-1，EZH2和IGFBP2的mRNA水平在低惡性膀胱移形細(xì)胞癌中差異表達(dá)，進(jìn)一步證實了聯(lián)合激光捕獲顯微切割與基因芯片進(jìn)行表達(dá)譜研究的可靠性。 3.應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究

13、了EZH2和BMI-1在膀胱癌組織中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果顯示：EZH2和BMI-1在膀胱癌中表達(dá)陽性率明顯高于正常膀胱粘膜中的表達(dá)陽性率，差異均有顯著意義(P＜0.05)。膀胱癌組織中EZH2的陽性表達(dá)隨著腫瘤病理分級的升高而增加(P＜0.05)，而與浸潤深度、復(fù)發(fā)與否、腫瘤大小均不具相關(guān)性(P＞0.05)。BMI-1的表達(dá)與膀胱癌復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P=0.032)，復(fù)發(fā)的膀胱癌患者多見BMI-1表達(dá)陽性，提示BMI-1的表達(dá)與膀胱癌的復(fù)

14、發(fā)有關(guān)。而BMI-1的表達(dá)與浸潤深度、病理分級、腫瘤大小均不具相關(guān)性(P＞0.05)。 4.系統(tǒng)水平上的功能聚類分析顯示，差異表達(dá)基因主要?dú)w屬于下列生物通路：WNT信號通路、MAPK信號通路、聚合粘附(Focaladhesion)、細(xì)胞增殖、泛素-蛋白酶體降解通路(Ubiquitinmediatedproteolysis)、緊密連接(tightjunction)、鈣信號通路、細(xì)胞周期調(diào)控等，這些通路很可能在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過程