利用激光捕獲顯微切割及基因芯片技術(shù)構(gòu)建喉鱗狀細(xì)胞癌基因組差異表達(dá)譜.pdf

1、研究目的： 喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的第二位，喉癌原發(fā)于聲帶部位者居多，約占60％。因?yàn)椴煌颊咚己戆┰诓±眍愋?、腫瘤分化程度、就診時(shí)病變嚴(yán)重程度等方面有差異，因此不同喉癌患者具有不同的臨床表現(xiàn)及體征，對(duì)手術(shù)后放療、化療的敏感性各有差異，所以如何找到早期診斷，療效監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物，將為實(shí)現(xiàn)對(duì)喉癌的個(gè)性化治療奠定理論基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)喉癌標(biāo)志物的研究主要集中在喉癌相關(guān)的單個(gè)基因功能研究，難以從整體上把握喉癌相關(guān)蛋白

2、或基因的變化，更未將顯微切割、組織純化技術(shù)引入到喉癌研究中，因此，使用高通量基因芯片、結(jié)合顯微切割、線性擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建并研究不同臨床分期的喉癌組織中癌細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜，對(duì)臨床篩選不同用途的分子標(biāo)記物具有重要的指導(dǎo)意義。 研究方法： (1)建立喉癌組織標(biāo)本庫(kù)及喉癌臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選嚴(yán)格配對(duì)的8例喉癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常的粘膜組織進(jìn)行研究。 (2)通過(guò)RNA保護(hù)以克服組織中RNA降解，應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)

3、以獲得純凈的癌細(xì)胞和純凈的正常喉粘膜上皮細(xì)胞，體外線性擴(kuò)增以解決RNA量少的問(wèn)題，結(jié)合人類全基因組寡核苷酸芯片HG-U133.Plus.2.0芯片，構(gòu)建了16例純化喉組織全基因組表達(dá)譜。 (3)對(duì)部分特異性候選靶基因進(jìn)行qRT-PCR,檢測(cè)基因的表達(dá)情況(4)從喉癌標(biāo)本組織庫(kù)中篩選50對(duì)標(biāo)本，即50例喉癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁正常的粘膜組織，制作成組織芯片，對(duì)部分基因進(jìn)行驗(yàn)證。 研究結(jié)果： (1)通過(guò)SAM等軟件分析

4、，將8對(duì)喉癌與癌旁正常組織表達(dá)譜依次進(jìn)行比較，篩選出差異基因2351個(gè)；將8對(duì)喉癌與癌旁正常組織表達(dá)譜進(jìn)行比較，再將早期癌與晚期癌進(jìn)行比較處理，篩選出差異基因761個(gè)。 (2)對(duì)篩選出的基因進(jìn)行GO分類，主要分為3大類：一、細(xì)胞組成為31.96％；二、分子功能為35.26％；三、生物學(xué)過(guò)程為32.78％。細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)：這些靶基因分別作用于細(xì)胞核、核膜，細(xì)胞漿及胞膜等部位，參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、多種酶活性、核酸結(jié)合

5、、核酸合成、修飾等功能過(guò)程。 (3)對(duì)篩選出的基因進(jìn)行信號(hào)通路(pathway)分析，篩選主要的信號(hào)通路為：細(xì)胞周期，以整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，基質(zhì)金屬蛋白酶，Wnt信號(hào)傳導(dǎo),炎癥反應(yīng)通路，TGF-β通路等主要的信號(hào)通路。 (4)對(duì)部分特異性候選靶基因進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，基因MMP12，KRT16，KRT19，HMGA2，在喉癌組織中均表現(xiàn)為上調(diào)，在正常的喉粘膜上皮中表達(dá)較弱或不表達(dá)?；騅RT23，RARB，PRB1

6、則在喉癌組織中均表現(xiàn)為下調(diào)。上述結(jié)果與基因芯片表達(dá)的結(jié)果是一致的。 (5)制作100例標(biāo)本的組織芯片，對(duì)候選靶基因MMP12，HMGA2，RARB進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：MMP12，HMGA2蛋白在喉癌組織中均出現(xiàn)顯著的高表達(dá)，而RARB蛋白在喉癌組織中則出現(xiàn)低表達(dá)，三種蛋白的異常表達(dá)提示其在喉癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。 研究結(jié)論： (1)通過(guò)RNA保護(hù)、激光捕獲顯微切割、微量RNA提取及線性擴(kuò)增等技術(shù)，結(jié)合全