依魯替尼對ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化和焦亡的調(diào)節(jié)作用及其與NLRP3炎癥小體關(guān)系的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化早期,單核細胞在趨化因子的作用下被招募至病變處,與內(nèi)皮細胞黏附,隨后遷移至內(nèi)皮下,轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。巨噬細胞攝入ox-LDL(oxidizedlow-density lipoprotein,氧化低密度脂蛋白)形成泡沫細胞,并大量死亡,形成動脈粥樣硬化斑塊的壞死核心,削弱纖維帽,增加斑塊不穩(wěn)定性。巨噬細胞的泡沫化和死亡是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　近年來NLRP3(nucleotide-binding olig

2、omerization domain-like receptor protein3,核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3)炎癥小體在動脈粥樣硬化中的作用越來越受到重視。研究顯示NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化的形成,并與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)。NLRP3炎癥小體可被ox-LDL激活,激活的炎癥小體可剪切caspase-1前體(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1),促進成熟I

3、L-1β(Interleukin-1β,白介素1β)的釋放,誘導巨噬細胞焦亡,還可能參與細胞脂質(zhì)沉積。
　　依魯替尼是一種口服的BTK(Bruton's tyrosine kinase,布魯頓酪氨酸激酶)抑制劑,臨床上被用來治療白血病。研究發(fā)現(xiàn)依魯替尼可抑制明礬誘導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活,尚不知其對ox-LDL誘導的NLRP3炎癥小體激活是否同樣有抑制作用。據(jù)此提出假說:依魯替尼可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活調(diào)節(jié)ox

4、-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化和焦亡。
　　目的:觀察依魯替尼對ox-LDL誘導的THP-1起源巨噬細胞泡沫化和焦亡的影響,探討其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。
　　方法:以PMA誘導的THP-1或THP-1-defNLRP3起源巨噬細胞為研究對象。給予ox-LDL,構(gòu)建細胞泡沫化、焦亡、遷移和黏附模型,并分別用依魯替尼和MCC950(NLRP3特異性抑制劑)進行處理。采用Western Blot、ELISA方法檢測巨噬細胞NL

5、RP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1、IL-1β水平,觀察ox-LDL對巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活的誘導作用,以及依魯替尼對ox-LDL誘導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活的影響。采用油紅O染色、酶學法、免疫熒光、流式等方法觀察依魯替尼對巨噬細胞泡沫化、細胞內(nèi)膽固醇含量、脂質(zhì)攝入及膽固醇外流的影響,并采用Western Blot方法檢測依魯替尼對調(diào)節(jié)巨噬細胞膽固醇平衡的關(guān)鍵蛋白水平的影響,及其與N

6、LRP3炎癥小體的關(guān)系。分別用依魯替尼、MCC950、VX765(caspase-1特異性抑制劑)等處理巨噬細胞,進行乳酸脫氫酶釋放檢測、Hoechst33342和碘化丙啶雙染及TUNEL染色,驗證ox-LDL對巨噬細胞焦亡的誘導作用,觀察依魯替尼對ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡的影響,以及其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系。采用transwell小室、劃痕實驗及細胞黏附實驗觀察依魯替尼對單核巨噬細胞遷移、黏附的影響及其與NLRP3炎癥小體的

7、關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　(1)依魯替尼可抑制ox-LDL誘導的THP-1起源的巨噬細胞NLRP3炎癥小體的激活。
　　(2)依魯替尼、MCC950和NLRP3基因敲除均可以調(diào)節(jié)THP-1起源的巨噬細胞CD36、ABCA1和SR-BI蛋白表達水平,抑制細胞對ox-LDL的攝入,促進游離膽固醇外流,減輕細胞泡沫化程度。
　　(3)Ox-LDL可促進THP-1起源巨噬細胞乳酸脫氫酶的釋放,增加PI染色細胞比率及TUNE