Daxx介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡與膽固醇蓄積的關(guān)系.pdf

1、目的：研究Daxx介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡與膽固醇蓄積的關(guān)系。 方法：用不同濃度的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)處理RAW264.7細(xì)胞48h，MTT法檢測ox-LDL對RAW264.7細(xì)胞生長的影響；流式細(xì)胞術(shù)和DNA斷裂片段分析法研究ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；用特異性siRNA沉默Daxx在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)，通過AO/EB染色觀察基因沉默后的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變；高效液相色譜(HPLC)檢測細(xì)胞內(nèi)膽固

2、醇含量；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況；RealtimeRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)DaxxmRNA、SCAPmRNA的表達(dá)情況；用WesternBlot印跡法檢測caveolin-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)不同濃度ox-LDL(0mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L)處理RAW264.7細(xì)胞48h后，MTF結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活性明顯下降，依次為100％±7.28％；103.2％±16

3、.35％；76.27％±16.54％；56.49％±11.94％；40.65％±8.76％，ox-LDL在25mg/L時就對細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯的抑制作用，IC50=50.6mg/L。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞凋亡率為2.3％，用12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/Lox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞48h，凋亡率分別為4.9％、8.6％、14.7％、33.1％，凋亡率呈明顯的濃度依賴性變化。此外，50mg/Lox

4、-LDL處理細(xì)胞不同時間(0h、12h、24h、48h、72h)，隨著ox—LDL作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率呈時間依賴性增加，50mg/Lox—LDL處理72h組凋亡率為27.9％。同時通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA斷片，50mg/Lox—LDL處理細(xì)胞48h組可觀察到凋亡特征性DNA梯形條帶。RealtimeRT—PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著ox—LDL濃度的遞增和作用時間的延長，DaxxmRNA的相對表達(dá)量呈濃度依賴性和時間依賴性增加。在50m

5、g/Lox—LDL處理細(xì)胞48h時DaxxmRNA的相對表達(dá)量達(dá)到最高(Daxx/β—actinmRNA由1.25×10—4上升至5.3×10—4)。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)50mg/Lox—LDL處理48h后，AO/EB染色顯示明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，出現(xiàn)核固縮、碎裂，同時細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量顯著增加(由76.3μg/mg蛋白上升至368.5μg/mg蛋白)，油紅O顯示細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴存在。用特異性siRNA沉默Daxx在RAW264.

6、7細(xì)胞中的表達(dá)能引起凋亡抑制，AO/EB染色顯示細(xì)胞凋亡率明顯降低，同時細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯下降(由368.5μg/mg蛋白下降至236.9μg/mg蛋白)，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴也明顯減少；Western—blot顯示caveolin—1表達(dá)呈時間依賴性上調(diào)，轉(zhuǎn)染DaxxsiRNA后其表達(dá)有所下調(diào)；RealtimeRT—PCR結(jié)果表明ox—LDL抑制SCAPmRNA的表達(dá)，經(jīng)RNA干擾后，SCAPmRNA的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：