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文檔簡介
1、目的:1、對海洋沉積物進(jìn)行系列性篩選,以獲得全新來源并具有潛在高性能的海因酶,并提供一種全新的海因酶陽性菌篩選體系和一種全新的酶優(yōu)化手段。2、構(gòu)建快速篩選模型,篩選性能更優(yōu)的海因酶突變體,并為同類酶的優(yōu)化提供依據(jù)。3、對海因酶工程菌進(jìn)行固定化研究,獲得全細(xì)胞固定海因酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)配方,為D-對羥基苯甘氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
方法:1、以實(shí)驗(yàn)室保存的鏈霉菌庫為篩選對象,利用唯一氮源法、雙層瓊脂法、微孔快速篩選法和分子生物學(xué)篩
2、選法對其進(jìn)行系列性篩選,獲得可表達(dá)海因酶的陽性鏈霉菌;從篩選獲得陽性菌中擴(kuò)增目的片段,分析基因序列并進(jìn)行工程菌構(gòu)建;測定海因酶的酶活和動力學(xué)參數(shù);利用Swiss-model在線軟件對海因酶進(jìn)行在線同源建模和Caver Analyst軟件對其的催化通道進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬分析;2、利用易錯PCR構(gòu)建海因酶突變庫;構(gòu)建快速篩選模型進(jìn)行突變酶篩選;對突變酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定;3、利用海藻酸鈉作為固定載體,對海因酶工程菌進(jìn)行全細(xì)胞固定化研究;優(yōu)化海藻酸
3、鈉濃度、硅藻土濃度、戊二醛濃度、CaCl2濃度和MnCl2濃度;測定固定化小球的最適直徑和最適添加濃度;測定固定化全細(xì)胞小球的批次實(shí)驗(yàn)次數(shù);測定固定化全細(xì)胞小球的機(jī)械強(qiáng)度。
結(jié)果:1、篩選獲得四株陽性菌,分別命名為S1、S14、S29和S145菌株,隨后對不同菌株來源的海因酶的酶動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,S145菌株來源的海因酶活性最高,為9.7 U/mg,催化動力學(xué)常數(shù) Kcat=3.2×10-6/s,Km=9.5 mm
4、ol/L;海因酶結(jié)構(gòu)的同源模建和催化通道模擬分析,結(jié)果顯示其主要催化通道Tunnel_1長度為9.1?,瓶頸氨基酸殘基為50位的組氨酸、181位的組氨酸和313位的谷氨酸,瓶頸半徑為2.18?;潛在催化通道Tunnel_2長度為13.6?,瓶頸氨基酸為62位的蘇氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶頸半徑為1.52?;2、篩選出七株陽性突變菌,突變位點(diǎn)主要集中在181位和286位;181位突變菌的酶活為11.5 U/mg,對產(chǎn)物的
5、耐受力提高10%;286位突變菌的酶活為11.0 U/mg,對底物的耐受力提高11%;3獲得固定化細(xì)胞的最優(yōu)配方為:3.0%海藻酸鈉、1.5%硅藻土、0.05%CaCl2和1.0 mM MnCl2;固定化小球最適直徑位2.6 mm,所占濃度最適為20%;固定化全細(xì)胞小球可重復(fù)使用12批次,其催化生產(chǎn)產(chǎn)物的產(chǎn)率為88%以上。
結(jié)論:1、開發(fā)了一種海因酶系列篩選策略,獲得潛在的酶優(yōu)化位點(diǎn),為后期酶的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ);2、篩選獲得了
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