大豆子葉折疊突變體cco的轉(zhuǎn)錄組分析及相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、子葉是大豆種子的主要營養(yǎng)儲存器官，對種子萌發(fā)、幼苗生長甚至后續(xù)整個植株的發(fā)育都具有重要的作用。近年來，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，子葉發(fā)育的分子機(jī)制的神秘面紗逐漸被揭開。大量的研究表明這個過程具有非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，涉及到眾多基因的互作、激素的誘導(dǎo)以及信號傳導(dǎo)等。盡管如此，人們對子葉發(fā)育機(jī)理的認(rèn)識還存在非常多的盲點。因此，本文以大豆子葉折疊突變體curled-cotyledon(cco)為實驗材料，從生理、形態(tài)和分子機(jī)理等方面進(jìn)行研究

2、;通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和熒光定量RT-PCR技術(shù)相結(jié)合篩選出兩個基因:Glyma17G138200與Glyma03G02300，通過基因工程等實驗手段進(jìn)一步研究其功能。
　　本研究首先對cco突變體進(jìn)行表型分析。相比于野生型，除生育期明顯延長外，cco突變體的大部分農(nóng)藝性狀都沒有明顯變化。除此之外，cco突變體的株高、百粒重、下胚軸長度和萌發(fā)率都顯著降低。cco突變體的遺傳分析顯示子葉折疊突變表型受3-4對基因控制。通過傳統(tǒng)的石蠟切

3、片方法進(jìn)一步觀察突變體早期的胚胎發(fā)育進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)子葉折疊突變表型起始于胚胎發(fā)育的球形期，且突變體魚雷期胚的子葉相比于野生型分叉加大，尖端更鋒利，像是“燕子的尾巴”。利用HPLC進(jìn)行激素測定，結(jié)果顯示cco突變體中生長素和脫落酸的含量顯著增加，而赤霉素含量卻顯著降低。
　　為了明確大豆子葉折疊突變體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選子葉發(fā)育相關(guān)基因，我們對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。以錯誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate: FDR）和|log

4、2Ratio|≥1為標(biāo)準(zhǔn)，鑒定了1，093個差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示20.46％的差異表達(dá)基因參與了植物激素的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉酸、脫落酸、乙烯、油菜素甾醇和茉莉酸等。轉(zhuǎn)錄組的研究表明cco突變體中生長素和脫落酸的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都是增強(qiáng)的，而赤霉素的早期合成步驟受到了阻遏，非活性赤霉素向活性赤霉素的轉(zhuǎn)變也受到了限制，這些結(jié)果同HPLC測定的結(jié)果一致?？傊琧co突變體中多種激素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)得到重排，這也很可

5、能是突變體表現(xiàn)多向性缺陷的原因。將RNA-seq同熒光定量RT-PCR結(jié)合，我們篩選了兩個基因Glyma17G138200（YABBY）與Glyma03G02300（LBD），進(jìn)一步對其進(jìn)行功能研究。
　　通過生物信息學(xué)的方法，在大豆基因組中一共鑒定了17個YABY基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示大豆YABBY家族分為5個亞家族:FIL、YAB2、YAB5、INO和CRC。Glymal7G138200屬于FIL亞家族，因大豆基因組中存在此基

6、因的另一個拷貝，故命名為GmFILa。GmFILa優(yōu)勢表達(dá)于葉片和發(fā)育的種子中，原位雜交結(jié)果顯示它特異的在葉、萼片等側(cè)生器官的遠(yuǎn)軸端表達(dá)。對GmFILa基因進(jìn)行克隆，發(fā)現(xiàn)GmFILa cDNA全長648 bp，編碼215個氨基酸，C端具有保守的鋅指區(qū)，N端具有YABBY區(qū)域。洋蔥表皮細(xì)胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)表明GmFILa基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核上。最后通過酶切連接方法構(gòu)建過表達(dá)載體pBI121-GmFILa轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)行功能驗證。結(jié)果表明，

7、GmFILa過表達(dá)擬南芥植株生育期延長、葉片狹長卷曲，且這種表型隨著葉齡的增加更加明顯。另外GmFILa還能阻止莖頂端分生組織的生長。對野生型和轉(zhuǎn)基因株系葉片表皮細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示GmFILa基因的過表達(dá)引起葉片近軸端表現(xiàn)為部分遠(yuǎn)軸化。生長素含量測定顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉片中生長素含量顯著降低。為了進(jìn)一步探討GmFILa基因作用的分子機(jī)理，我們對野生型和GmFILa過表達(dá)擬南芥植株進(jìn)行了表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因同生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

8、、脅迫等相關(guān)。總之，GmFILa基因特異的控制側(cè)生器官遠(yuǎn)軸端的發(fā)育，對葉片的激發(fā)和腹背模式的建立具有重要的作用，且它的上調(diào)表達(dá)能夠抑制自由態(tài)生長素的含量。cco突變體早期發(fā)育的種子中生長素含量顯著增加，種子中GmFILa基因表達(dá)受到了抑制，推測GmFILa基因很可能通過調(diào)控生長素參與cco突變體的發(fā)育。
　　Glyma03G02300編碼了LBD轉(zhuǎn)錄因子，命名為GmLBD1。大豆基因組中鑒定了86個LBD基因，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示Gm

9、LBDl同 AtLBD18、AtLBD19和AtLBD31聚為一支，暗示其功能相似性。GmLBD1位于3號染色體，cDNA全長為756 bp，編碼251個氨基酸，基因組序列有兩個外顯子和一個內(nèi)含子。洋蔥表皮細(xì)胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)表明GmLBD1基因編碼蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。通過酶切連接方法構(gòu)建過表達(dá)載體pBI121-GmLBD1，轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果顯示同野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目顯著增加，且根中自由態(tài)生長素的含量顯著增加。GmLBD