蛋白類重要生物標志物的分離純化和定量技術(shù)的研究.pdf

1、基體標準物質(zhì)相對于純品標準物質(zhì)，更接近于待測物質(zhì)的真實情況，用于定量時測量結(jié)果更精確。本實驗研究血清中生物標志物的提純和定量，基于免疫磁珠富集工藝，實現(xiàn)了血清中低豐度生物標志物的分離和純化，建立了準確定量目標物的方法，為血清基體標準物質(zhì)研制提供參考。
　　由于血清基體中蛋白質(zhì)種類繁多，為了避免基質(zhì)效應(yīng)，實現(xiàn)對于特定低豐度蛋白的分離純化，使其達到定量方法的檢測限，需要對目標物特異性提純。本研究采用免疫磁珠富集工藝，通過結(jié)合單克隆抗體

2、的磁珠將血清中目標蛋白提純，實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)的富集。將提純后的蛋白質(zhì)經(jīng)過酶切過程分解為特征肽段，通過對特征肽段定量實現(xiàn)血清中蛋白質(zhì)定量的目的。
　　為了準確測定作為定量特征肽段基準的合成肽段純度，本研究以合成胰高血糖素為例，建立了質(zhì)量平衡法測定固相合成肽段純度的定量方法。分別對目標物中雜質(zhì)準確定量，總質(zhì)量扣除雜質(zhì)質(zhì)量得到樣品純度為89.64％。該結(jié)果相比于常用的高效液相法(98.37％)精確度更高。
　　將方法用于血清中小分子

3、多肽的分離純化和定量，本研究選用糖尿病生物標志物C肽為例。通過免疫磁珠富集技術(shù)，實現(xiàn)血清中C肽的分離和提純，建立了同位素稀釋質(zhì)譜法對血清中C肽的定量方法。通過添加同位素標記C肽為參考，優(yōu)化免疫磁珠富集過程，得到免疫磁珠富集效率為80.22％。采用同位素稀釋質(zhì)譜法對血清中分離純化后的C肽進行定量，得到其濃度為10.80ng/mL。
　　通過對免疫磁珠富集工藝中磁珠與抗體的結(jié)合效率、抗體與蛋白的結(jié)合效率、抗體的負載量、洗脫時間因素的優(yōu)

4、化，設(shè)計了結(jié)合單克隆抗體的聚苯乙烯磁珠分離純化血清中C反應(yīng)蛋白的工藝。采用胰蛋白酶方法對C反應(yīng)蛋白進行酶切，通過添加超濾技術(shù)提高蛋白的酶切效率，使得肽圖覆蓋率提高至86.16％，同時得到其特征肽段為ESDTSYVSLK(EK)。通過對合成特征肽段EK的質(zhì)譜定量，得到樣品血清中C反應(yīng)蛋白酶切后EK濃度為0.10ug/mL，依據(jù)特征肽段和C反應(yīng)蛋白物質(zhì)的量關(guān)系，計算得到樣品血清中C反應(yīng)蛋白的含量為2.06ug/mL。
　　本實驗建立的