肝癌潛在標(biāo)志物循環(huán)microRNAs定量檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、microRNAs（miRNAs）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的保守性非編碼小分子RNA，通過(guò)與目標(biāo)信使RNAs(message RNAs，mRNAs)的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，影響細(xì)胞生理活動(dòng)。研究表明，多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程均伴隨有miRNAs的異常表達(dá)，使得miRNAs作為肝病潛在標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)。最近，miRNAs的高度穩(wěn)定性引起了人們的廣泛關(guān)注，它們存在于

2、所有體液環(huán)境中，或被脂質(zhì)囊泡包裹，或與蛋白質(zhì)結(jié)合，免于RNase的降解。循環(huán)miRNAs與肝臟的病理狀態(tài)同樣具有緊密的聯(lián)系，這使得循環(huán)miRNAs可能為無(wú)創(chuàng)肝病診斷提供有效的解決方案。
　　準(zhǔn)確測(cè)定miRNAs在特定細(xì)胞、組織、體液中的表達(dá)量是將miRNAs作為標(biāo)志物應(yīng)用于疾病診斷與預(yù)后監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵性步驟。本論文建立的miRNAs檢測(cè)技術(shù)，具有特異性好、靈敏度高、線性范圍廣等特點(diǎn)，并能夠用于臨床血清樣本miRNAs定量檢測(cè)，在疾病早

3、期診斷與預(yù)后評(píng)估中有潛在應(yīng)用前景。主要內(nèi)容如下:
　　1.基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的miRNAs檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　建立了一種基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的miRNAs檢測(cè)方法。目標(biāo)miRNAs與固定在Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒上的捕獲探針和標(biāo)記有生物素的信號(hào)探針雜交，通過(guò)生物素-鏈霉親和素作用進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)標(biāo)記，ALP與其化學(xué)發(fā)光底物3-(2'-螺旋金

4、剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明，該方法特異性較好，能夠靈敏地區(qū)分完全配對(duì)（陽(yáng)性組）和完全錯(cuò)配（陰性組）目標(biāo)序列，檢測(cè)限達(dá)60 fM，線性范圍（10-2-104 pM）覆蓋6個(gè)數(shù)量級(jí)，能夠用于臨床血清樣本中miRNAs檢測(cè)，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　2.基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的miRNAs檢測(cè)方法的應(yīng)用
　　應(yīng)用poly(A)聚

5、合酶加尾定量PCR對(duì)血清樣本中miR-21進(jìn)行定量檢測(cè)。定量結(jié)果與采用第2章方法的定量結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法對(duì)血清樣本miR-21的定量結(jié)果基本一致，表明第2章建立的基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的miRNAs檢測(cè)法能夠用于miRNAs定量，定量結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
　　3.肝癌相關(guān)miRNAs相對(duì)表達(dá)水平的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
　　應(yīng)用建立的基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的miRNAs檢測(cè)方法對(duì)臨床血清樣本進(jìn)行miR-21、m