HLA四聚體復合物檢測系統(tǒng)的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T 1ymphocytes,CTLs)的鑒定是研究CTL疫苗的基礎(chǔ).定量分析抗原特異性T細胞能為免疫應(yīng)答的發(fā)生過程提供重要的信息.傳統(tǒng)的鑒定方法費時費力,敏感性低,近年來出現(xiàn)了一種新的檢測方法,即可溶性HLA肽四聚體方法.實驗表明,該方法克服已有檢測手段的缺點和局限性,這種四價的重組分子在體外可有效標記T細胞抗原識別受體(TCR),并適用于流式細胞儀檢測CTLs,由于該技術(shù)應(yīng)用原核表達重

2、組蛋白,其來源容易,僅需不同的抗原肽就可制備重組分子,因此近期得到了廣泛應(yīng)用.本實驗旨在國內(nèi)率先建立可溶性HLA-A2-CEA四聚體檢測系統(tǒng),為腫瘤的細胞免疫機制研究提供一個方便、準確的研究平臺.研究內(nèi)容如下:一、PCR-SSP結(jié)合測序分析快速篩選HLA-A*0201亞等位基因成功建立相對簡單經(jīng)濟的檢測HLA-A*0201等位基因的方法,利用位點特異性引物進行2-3次PCR擴增,結(jié)合PCR產(chǎn)物測序即可快速篩選HLA-A*0201陽性的個

3、體,滿足我們所構(gòu)建的HLA-A2表位肽四聚復合物檢測系統(tǒng)進一步實驗的需要.本研究不僅創(chuàng)建了篩選特定等位基因——HLA-A*0201的方法,同時也為快速檢測其它特定HLA等位基因提供了經(jīng)濟實用的模式,具有較高的實際應(yīng)用和參考價值.二、可溶性HLA-A2-CEA四聚體復合物的構(gòu)建在成功地擴增了HLA-A*0201兩個亞單位(重鏈、輕鏈)后,將可生物素化的序列連接到HLA-A2重鏈胞外區(qū)末端,分別構(gòu)建成可溶性重組分子,進行原核表達.再利用6x

4、Histiding tag進行蛋白純化,在對HLA-A2分子高親和力的CEA694-702(癌胚抗原優(yōu)勢T細胞表位多肽GVLVGVALI)存在下,三者體外折疊成具有完整構(gòu)象的HLA-A2-CEA分子復合物.以BirA酶作用于復合物中的融合于HLA重鏈蛋白C端BSP中的賴氨酸殘基,生物酰化該復合物.生物?；腍LA肽復合物與藻紅蛋白(PE)標記的親和素以4:1結(jié)合,形成均一的四聚體結(jié)構(gòu).利用Streptavidin-shift assay