CD1d四聚體檢測技術(shù)的初步改良.pdf

1、NKT細(xì)胞TCR識(shí)別由非胸腺依賴抗原與CDld結(jié)合而成的復(fù)合物。Α-GalCer為目前發(fā)現(xiàn)的NKT細(xì)胞結(jié)合效能最強(qiáng)的糖脂抗原,其可以裝載入CDld分子抗原結(jié)合溝槽,應(yīng)用此糖脂和分子所建立的CDld四聚體技術(shù)是檢測NKT細(xì)胞的權(quán)威
　　 方法。
　　 肝臟是機(jī)體最大的消化與代謝器官,然而其在免疫學(xué)領(lǐng)域的作用日漸清晰,甚至有人已把肝臟作為獨(dú)立的免疫器官；NKT細(xì)胞在肝內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞比率達(dá)到8％-15％,為所有具備淋巴樣器官中最

2、多的器官。本試驗(yàn)即利用肝臟內(nèi)NKT細(xì)胞比率較高的特性,以評(píng)定不同制備條件建立的四聚體檢測效果,從而對(duì)其制備條件進(jìn)行改良。不同肝臟單個(gè)核細(xì)胞制備方法可對(duì)NKT細(xì)胞比率產(chǎn)生影響,選擇一種穩(wěn)定的制備方法也是保證改良方案實(shí)施的重要基礎(chǔ)。
　　 Tween-20是常用的實(shí)驗(yàn)室有機(jī)助溶劑,屬水包油型乳化劑,可用作增溶劑、擴(kuò)散劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑和抗靜電劑。CDld四聚體在制備過程中用含有Tween-20的PBS分散糖脂抗原是能否建立成功四聚體

3、的關(guān)鍵步驟,但其亦能對(duì)反應(yīng)體系造成不利影響,因而在保證其分散效果的同時(shí)也應(yīng)該控制Tween-20在整個(gè)反應(yīng)體系里的量才能找到一個(gè)理想的平衡點(diǎn)。Α-GalCer與融合蛋白的孵育時(shí)間是CDld四聚體制備過程的限速步驟,現(xiàn)今的制作流程中二者的孵育時(shí)間皆在12小時(shí)以上,這完全限制了CDld四聚體技術(shù)的快速應(yīng)用。
　　 本研究建立的CDld四聚體技術(shù)可對(duì)小鼠胸腺、脾臟、肝臟iNKT細(xì)胞進(jìn)行檢測,并對(duì)CDld四聚體制作過程的PBS所含Twe

4、en-20濃度及α-GalCer與融合蛋白的孵育時(shí)間進(jìn)行摸索,希求應(yīng)用最少的Tween-20及最短的孵育時(shí)間達(dá)到良好穩(wěn)定的檢測效果的目的。
　　 方法：
　　 以肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞為檢測對(duì)象,利用含Tween-20不同濃度PBS所建立CD1d四聚體檢測其NKT比率,通過對(duì)比Tween-20濃度不同對(duì)CD1d四聚體檢測效率的差異,確定最合理的Tween-20濃度；以肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞為檢測對(duì)象,利用糖脂α-Ga1Cer與CD1

5、d-IgG1 Fc融合蛋白經(jīng)不同孵育時(shí)間所建立CD1d四聚體對(duì)其NKT比率進(jìn)行檢測,通過對(duì)比孵育時(shí)間的不同對(duì)CD1d四聚體檢測效率的差異,確定最合理的孵育時(shí)間。
　　 結(jié)果：
　　 CD1d四聚體檢測NKT方法的建立應(yīng)用保守建立方法,即用含Tween-201％的PBS稀釋?duì)?Ga1Cer糖脂儲(chǔ)存液,并與CD1d-IgG1 Fc融合蛋白孵育過夜12小時(shí)所建立的四聚體檢測液對(duì)所提純肝臟單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾臟單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行

6、檢測,可檢測到NKT細(xì)胞亞群,其檢測陽性比率與國外文獻(xiàn)相符,表明四聚體建立成功。
　　 用含不同濃度Tween-20 PBS(0.00％、0.05％、0.10％、0.25％、0.50％、1.00％、2.00％)制備的CD1d四聚體檢測肝臟單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)NKT細(xì)胞,對(duì)其檢測效率進(jìn)行比較,在0.5％至2％范圍內(nèi)增加時(shí),所測得NKT細(xì)胞比率稍有下降趨勢或比率相當(dāng),統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Tween-20濃度在0.5、1％、2％時(shí),三者的檢出能力無統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)差異,顯示Tween-20在0.5％時(shí)即能制備出具有完整檢出能力的CD1d四聚體。
　　 不同糖脂α-Ga1Cer與CD1d-IgG1 Fc融合蛋白裝載時(shí)間(1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h)所制備的CD1d四聚體檢測肝臟單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)NKT細(xì)胞,對(duì)其檢測效率進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)表明,隨裝載時(shí)間在1h、2h、4h、6h、8h范圍內(nèi)不斷增加,所測得NKT細(xì)胞比率不斷增加；在8h、12h、24h范圍內(nèi)增加時(shí),所測得NKT細(xì)胞比

8、率稍有下降趨勢或比率相當(dāng),統(tǒng)計(jì)學(xué)處理裝載時(shí)間在8h、12h、24h時(shí),三者的檢出能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,顯示裝載時(shí)間8h時(shí)即能制備出具有完整檢出能力的四聚體。
　　 結(jié)論
　　 建立CD1d四聚體檢測技術(shù),可以對(duì)肝臟、胸腺、脾臟NKT細(xì)胞進(jìn)行檢測。在CD1d四聚體制備過程中,用于分散α-Ca1Cer糖脂抗原的PBS所含Tween-20的濃度可降低到0.5％。在CD1d四聚體制備過程中,α-Ca1Cer和CD1d-IgG1 Fc