hCGβ-CTP四聚體與C3d片段融合蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是由胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白激素，在早期妊娠中起促進(jìn)胚泡發(fā)育、維持妊娠的作用。由于hCG是妊娠期出現(xiàn)的具有時(shí)間特異性的激素，因此最初作為避孕疫苗設(shè)計(jì)的理想靶分子。hCG疫苗是目前研究最為成熟的一種免疫避孕疫苗，已完成Ⅱ期臨床研究。近年來(lái)的研究表明，除了生殖細(xì)胞腫瘤如子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌外，大多數(shù)上皮細(xì)胞惡性腫瘤也能異位表達(dá)hCG類分子，主要

2、以hCGβ形式存在，并隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步增殖擴(kuò)散，其hCG的表達(dá)量會(huì)不斷增加，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最高值。研究表明，hCG在腫瘤生長(zhǎng)、血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸中起重要作用。因此，hCG作為一種腫瘤相關(guān)抗原，其疫苗還可以用于惡性腫瘤的治療。 hCG與糖蛋白激素家族的其他成員促甲狀腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)具有相同的α亞基，其中hCGβ亞基與LH的β亞基有較高的同源性，兩者前115個(gè)

3、氨基酸有82％的同源性。CTP(即hCG羧基端第109-145位氨基酸殘基組成的37肽)是hCG分子所特有，它含有hCGβ的線性表位β<,8>和β<,9>，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有更好的抗原特異性。不足之處是CTP的分子量小，免疫原性差，產(chǎn)生的抗體中和完整hCGβ分子的能力低。 C3d是補(bǔ)體C3的裂解片段，其受體CR2是140 kD的糖蛋白，分布于B細(xì)胞、濾泡樹(shù)突細(xì)胞和一些T細(xì)胞。C3d與抗原共價(jià)連接后，通過(guò)其特異性受體CR2將信號(hào)

4、提供給免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。許多研究表明，抗原與3拷貝的C3d連接后在蛋白免疫或基因免疫時(shí)可以大大增強(qiáng)該抗原免疫原性。C3d分子作為一種新型分子佐劑引起研究者的關(guān)注。 本研究室前期工作已在畢赤酵母和大腸桿菌中成功地表達(dá)了CTP二聚體、三聚體、四聚體，并制備了相應(yīng)的多克隆抗體，證明了hCGβ-CTP多聚體產(chǎn)生的抗體滴度高于單體產(chǎn)生的抗體滴度。 為了進(jìn)一步提高h(yuǎn)CGβ-CTP多聚體的免疫原性，簡(jiǎn)化疫苗的制備工藝，我們

5、在重組的hCGβ-CTP多聚體的基因上連接了分子佐劑C3d基因的三聚體，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9Khis6(CTP)n和pPIC9Khis6(CTP)n(n=3，4)3C3d，在畢赤酵母細(xì)胞GS115中篩選得到含高拷貝目的基因的克隆并表達(dá)目的蛋白。重組蛋白中加入了分子佐劑C3d三聚體，不需要在蛋白表達(dá)純化后再次偶聯(lián)化學(xué)佐劑，簡(jiǎn)化了疫苗的制備工藝。但是我們發(fā)現(xiàn)，雖然我們采用的是畢赤酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，但是蛋白并沒(méi)有分泌到培

6、養(yǎng)上清中，而在酵母胞內(nèi)表達(dá)。蛋白的胞內(nèi)表達(dá)、酵母破壁困難、低表達(dá)量、背景蛋白多以及非變性條件下his-tag不能與Ni-NTA-Sepharose結(jié)合等給純化帶來(lái)了很大困難。由于蛋白表達(dá)量較低，胞內(nèi)背景蛋白較多，經(jīng)過(guò)幾步純化，蛋白純度有所提高，但要得到一定量的蛋白供后續(xù)實(shí)驗(yàn)有困難。原核表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚，具有成本低、周期短、易操作及表達(dá)量高的特點(diǎn)，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行了表達(dá)?？紤]到目的蛋白分子量比較大，表達(dá)可能存在困難，

7、構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET=28a(+)-(CTP)<,4>-3C3d和pGEX4T-2-(CTP)<,4>-3C3d，觀察蛋白在兩種表達(dá)載體中的表達(dá)情況，但表達(dá)不理想，這可能與蛋白分子量太大有關(guān)，因?yàn)閮H3C3d的分子量就可達(dá)105 kD。 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于C3d分子第1209-1236位氨基酸的P28肽段，在體外可以與CR2陽(yáng)性的Raji細(xì)胞結(jié)合，并可被C3d分子競(jìng)爭(zhēng)性抑制及CR2單抗特異阻斷，認(rèn)為P28肽含有CR2的結(jié)

8、合位點(diǎn)。有研究表明來(lái)源于該區(qū)域的P16肽可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的抗CEA抗體。含不同拷貝C3d-P28編碼基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行基因免疫，能不同程度地增強(qiáng)HBV-preS2/S誘導(dǎo)的特異性體液免疫及其蛋白加強(qiáng)后的回憶反應(yīng)，其中4拷貝C3d-P28的增強(qiáng)作用較為顯著。因此，我們以P28代替C3d，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-(CTP)<,4>-(C3d-P28)<,4>，一方面大大減小了融合蛋白的分子量，利于表達(dá)，另一方面研究C3d-P2

9、8對(duì)偶聯(lián)抗原的免疫作用。 我們對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)Ni-NTA-Agarose和凝膠過(guò)濾方法純化蛋白，得到純度較高的融合蛋白。Bradford方法定量蛋白，相同分子數(shù)的蛋白免疫BALB/c雄性小鼠，共分為三組，Ⅰ組直接用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>免疫，Ⅱ組用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>加弗氏佐劑免疫，Ⅲ組直接用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>-(C3d-P28)<,4>免疫，制備了多克隆抗體。常規(guī)ELISA間接法