CFTR低表達(dá)在HHcy致ApoE---鼠動(dòng)脈粥樣硬化脂代謝紊亂中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬觀察肝臟組織囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）表達(dá)改變及其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（en-doplasmic reticulum stress，ERS）在高同型半胱氨酸血癥（hyperhomo cysteinemia，HHcy）致ApoE－/－鼠動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)脂代謝紊亂中的作

2、用及其機(jī)制，探討HHcy致AS的可能作用靶點(diǎn)。
　　方法：
　　選用SPF級(jí)近交系C57BL/6J背景的5周齡雄性ApoE－/－小鼠為研究對(duì)象，適應(yīng)環(huán)境一周后，將小鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（n＝6）：選擇健康5周齡雄鼠（SPF級(jí)C57BL/6J），飼以正常飲食。另選5周齡雄性純合子 ApoE－/－鼠（SPF級(jí)近交系C57BL/6J）18只，隨機(jī)分為3組，每組6只：ApoE－/－對(duì)照組、高蛋氨酸組、干預(yù)組，分別給予正常飲食、

3、高蛋氨酸飲食、高蛋氨酸飲食加0.006%葉酸及0.0004%維生素B12。喂養(yǎng)14周后眼球取血，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清同型半胱氨酸水平；主動(dòng)脈病理切片進(jìn)行HE染色、肝臟冰凍切片進(jìn)行油紅O染色；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDL、HDL、TG、CHOL含量；DAPI染色觀察肝組織細(xì)胞核；透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)；實(shí)時(shí)定量熒光 PCR檢測(cè)小鼠肝組織CFTR、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78

4、，GRP78）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor6，ATF6）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、X盒結(jié)合蛋白-1（X-box binding protein-1，XBP-1）mRNA的表達(dá)以及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠腎臟CFTR蛋白的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked i

5、mmunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)肝組織中caspase-12、Grp78、ATF6、PERK、XBP-1的含量；
　　結(jié)果高蛋氨酸組小鼠血清Hcy水平顯著增加（P<0.01），干預(yù)組血清Hcy水平較高蛋氨酸組降低（P<0.05）；主動(dòng)脈HE染色結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，高蛋氨酸組小鼠主動(dòng)脈管壁可見大量動(dòng)脈粥樣硬化樣物質(zhì)，干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈管壁病變較高蛋氨酸組有所緩解。由此表示，小鼠HHcy和動(dòng)脈粥樣硬化雙模型建

6、立成功。
　　全自動(dòng)生化儀結(jié)果顯示高蛋氨酸組血清LDL、TG、CHOL含量顯著增加(P<0.01)、血清HDL含量顯著降低（P<0.01），干預(yù)組血清LDL、TG、CHOL含量較高蛋氨酸組降低（P<0.05）、血清HDL含量較高蛋氨酸組增加（P<0.05）；肝臟油紅O染色結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，高蛋氨酸組小鼠肝臟可見大量脂滴存在，干預(yù)組小鼠肝臟脂滴較高蛋氨酸組減少。
　　4000倍鏡下線粒體腫脹或濃縮、嵴斷裂或變短、粗面內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均大量增生，干預(yù)組線粒體略有腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有增生。實(shí)時(shí)定量熒光 PCR結(jié)果顯示，高蛋氨酸組GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表達(dá)組顯著增加（P<0.01），干預(yù)組GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表達(dá)較高蛋氨酸組顯著降低（P<0.01）；ELISA結(jié)果表明高蛋氨酸組Grp78、PERK、ATF6、XBP-1含量顯著增加（P<0.01），干預(yù)組血清Grp78、PERK

8、、ATF6、XBP-1含量較高蛋氨酸組降低（P<0.05）。
　　DAPI染色結(jié)果顯示高蛋氨酸組可見細(xì)胞核增大，細(xì)胞核膜與周圍邊界不清晰，干預(yù)組細(xì)胞核則大小較均一，核膜光滑。透射電鏡結(jié)果顯示700倍鏡下高蛋氨酸組染色質(zhì)聚集濃縮或邊緣化，可見凋亡小體及前體，干預(yù)組細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)略微聚集凝固未見凋亡小體及前體。ELISA結(jié)果顯示高蛋氨酸組caspase-12的含量顯著增加（P<0.05）干預(yù)組caspase-12的含量含量較高蛋氨

9、酸組降低。
　　實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示，高蛋氨酸組CFTR mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.01），干預(yù)組CFTR mRNA的表達(dá)較高蛋氨酸組顯著增加（P<0.01）；小鼠肝組織經(jīng)免疫組化染色后通過Image Pro Plu6.0軟件統(tǒng)計(jì)CFTR蛋白陽性染色區(qū)域，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CFTR蛋白的表達(dá)與其mRNA的表達(dá)變化一致；
　　小鼠肝臟CFTR mRNA表達(dá)與GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA表達(dá)的