青葙總皂苷對(duì)ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用及其促進(jìn)自噬的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:研究青葙子(Celosiae Semen)中的三萜皂苷類化合物青葙總皂苷(TotalCeosins，TCS)抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用及其機(jī)制，為TCS抗動(dòng)脈粥樣硬化新藥的研制及青葙資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):通過給予ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠高脂飲食12周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，設(shè)置TCS3個(gè)給藥劑量:10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg體重，給藥4周，觀察對(duì)動(dòng)脈粥

2、樣硬化小鼠斑塊面積和穩(wěn)定性的影響。
　　體外實(shí)驗(yàn):通過ox-LDL刺激腹腔巨噬細(xì)胞24h，建立動(dòng)脈粥樣硬化體外模型-泡沫細(xì)胞模型。在此基礎(chǔ)上，分別從TCS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬、泡沫細(xì)胞的形成、相關(guān)基因mRNA的表達(dá)、細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)以及對(duì)自噬小體的形成和自噬流的影響來探討其藥理作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　TCS抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥效學(xué)研究:TCS10mg/kg～90mg/kg劑量范圍內(nèi)，能夠顯著性減少ApoE-

3、/-小鼠主動(dòng)脈中斑塊相對(duì)面積，減少主動(dòng)脈內(nèi)壁增生，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有明顯治療作用。具體如下:1.主動(dòng)脈整體油紅O染色結(jié)果顯示:模型組主動(dòng)脈中有大量的斑塊存在，主動(dòng)脈上游斑塊較大，向管腔中凸起明顯，至主動(dòng)脈下游仍有較多斑塊存在。給與TCS后，主動(dòng)脈內(nèi)斑塊不同程度的減少，可見斑塊區(qū)域減少，斑塊面積明顯減小，在主動(dòng)脈的上游可見成型的小顆粒狀斑塊，在主動(dòng)脈中下游斑塊急劇減少，幾乎不可見。2.主動(dòng)脈根部橫切面油紅O染色病理切片顯示:模型組主動(dòng)脈管腔

4、內(nèi)脂肪堆積明顯，三個(gè)主動(dòng)脈瓣對(duì)應(yīng)的動(dòng)脈壁上均有斑塊，且斑塊較厚，占整個(gè)動(dòng)脈管腔的橫切面積較大。給藥后，主動(dòng)脈根部管腔脂肪沉積減少，管腔壁斑塊面積減小，TCS中劑量和高劑量組，部分主動(dòng)脈壁較為光滑，未見明顯的脂肪堆積和斑塊存在。3.主動(dòng)脈根部橫切面H&E染色病理切片顯示:模型組主動(dòng)脈管腔內(nèi)，斑塊面積較大，在部分斑塊中出現(xiàn)壞死區(qū)域且有大量的膽固醇積累;TCS給藥組斑塊體積不同程度的減少，壞死核心面積減少且膽固醇累積明顯減少。4.主動(dòng)脈根部橫

5、切面天狼猩紅染色病理切片顯示:模型組斑塊中總膠原量少，Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原的比值小，表明斑塊趨于不穩(wěn)定;與模型組相比，TCS給藥組斑塊中總膠原量較多，Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原的比值大(P＜0.01)，表明斑塊趨于穩(wěn)定。5.主動(dòng)脈根部橫切面組織免疫熒光觀察結(jié)果顯示，與模型組相比，TCS給藥組主動(dòng)脈根部與自噬相關(guān)的自噬小體的數(shù)量明顯增多(P＜0.01)，推測(cè)其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用可能與促進(jìn)自噬有關(guān)。
　　TCS抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究:體外實(shí)

6、驗(yàn)證明，TCS能夠減少巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吞噬作用，當(dāng)TCS濃度為50μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吞噬顯著性減少(P＜0.01)。在12.5μg/mL～50.0μg/mL劑量范圍內(nèi)，能夠顯著減低泡沫細(xì)胞的形成率(P＜0.05或P＜0.01)，減低TC含量(P＜0.01）。在mRNA水平上，在12.5μg/mL～50.0μg/mL劑量范圍內(nèi)，清道夫B類受體CD36和清道夫A類受體SR-A1分別最大下調(diào)了56.5％和62.4％，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)

7、運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1(ATP-binding cassette sub-family G member1，ABCG1)分別上調(diào)了3.1倍和1.9倍。在蛋白水平上，在12.5～50.0μg/mL劑量范圍內(nèi)，輕鏈蛋白3(light chain3，LC3)和自噬蛋白beclin1表達(dá)量增加，表明TCS能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬水平增加。電鏡下觀察，TC

8、S組中自噬小體數(shù)量明顯高于ox-LDL刺激組中自噬小體數(shù)量。激光共聚焦顯微鏡下觀察，TCS組自噬溶酶體/自噬體比值顯著性高于ox-LDL組(P＜0.01)，表明TCS能夠促進(jìn)自噬溶酶體的形成。
　　結(jié)論:TCS能夠顯著減小主動(dòng)脈內(nèi)斑塊面積，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮較好治療作用。在細(xì)胞水平，TCS能夠減少巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吞噬，減少泡沫細(xì)胞的形成;在mRNA水平上，TCS能夠下調(diào)CD36的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)ABCA1、ABCG1的表達(dá);TC