體外循環(huán)對大鼠腸屏障功能損傷機制探討及生態(tài)制劑的干預作用.pdf

1、鑒于CPB應激反應的特殊性以及SDD和微生態(tài)制劑的上述作用，本研究除從細胞、分子和基因水平上探討CPB對腸屏障功能損傷的機制外，還將進一步探討生態(tài)療法用于CPB后腸屏障保護的可行性。旨在為其臨床應用提供實驗依據(jù)，亦為臨床減少CPB手術后胃腸道并發(fā)癥提供有效的防治措施。 實驗材料與方法： 一、實驗材料 1、實驗動物：健康雄性SD大鼠，體重350～450g。 2、主要試劑及藥品：二胺氧化酶(DA0)、D-乳酸

2、標準品(Sigma公司，美國)，TNF-α、IL-6、IL-10免疫組化試劑盒(天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司)，水合氯醛(上海化學試劑采購供應站分裝廠)；抗occludin、ZO-1抗體(zymed公司，美國)，)金雙岐(麗珠醫(yī)藥集團)，sIgA雙抗夾心放免法試劑盒(邦定公司提供)，妥布霉素(常州蘭陵制藥有限公司)，20％乳果糖(云南通用善美制藥有限責任公司)，大蒜素(廈門魚肝油廠)。 3、主要儀器：高速離心機(TDL-SA)；

3、三用電熱恒溫水浴箱(DH)’-600)；多功能振蕩器；倒置顯微鏡(OLYMPUS-Ix70 Model，Japan)；RX-2000型全自動生化分析儀(美國Technicon公司)；TKR-200C小動物呼吸機(江蘇特力麻醉呼吸設備公司)；特制微型膜肺(廣東科威醫(yī)療器械有限公司提供采)；小型蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司，BT002300M型)。 二、實驗方法 1、大鼠CPB的建立 取雄性SD大鼠，以10％水合氯

4、醛350 mg·kg-1腹腔內注射麻醉，氣管插管接小動物呼吸機輔助呼吸。通過微型化CPB環(huán)路設備，經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動脈灌注方法建立大鼠CPB模型。 2、實驗分組 SD大鼠48只隨機分為SH、CPB、Y和SDD四組，CPB組24只，其余每組8只。 SH組：為假手術對照組(Sham-operated group，SH)，大鼠只在相應部位插管，但不進行CPB轉流。 CPB組：分設CPB60min結束時和

5、停CPB后2、4h時三個相點。 Y組：為益生菌組，在實驗開始前7天，每日用金雙岐(由雙歧桿菌、乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌組成的三聯(lián)活菌制劑，含活菌數(shù)1億/g)懸液2ml灌胃。SDD組：為選擇性消化道去污組，在實驗開始前3天，每日用三聯(lián)抗生素懸液2ml(妥布霉素100 mg+20％乳果糖5ml/kg+大蒜素10mg/kg)灌胃。 3、觀察指標和檢測方法 (1)圍CPB期血液動力學變化； (2)血漿DAO活性、D-

6、乳酸、LPS濃度的變化(化學法)； (3)血漿IL-6、IL-10、TNF-α和sIgA的變化(放免法)； (4)遠隔臟器的細菌易位，腸上皮組織病理檢查(光鏡)；腸粘膜超微結構的檢查(電鏡)； (5)腸粘膜Occludin和ZO-1蛋白表達(免疫組織化學法和Western blot法)。 實驗結果： 一、各組大鼠腸屏障功能的變化 1、血漿DAO活性和D-乳酸濃度變化 CPB組各時相

7、點血漿DAO活性和D-乳酸濃度均明顯升高，與SH組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以CPB后2h時最高(P<0.05)。而SH組的DAO活性和D-乳酸濃度無明顯變化(P>0.05)。Y組和SDD組血漿中DAO活性和D-乳酸濃度與CPB組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與SH組相比仍有所升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2、血漿LPS濃度變化和遠隔臟器的細菌易位 CPB組靜脈血漿LPS濃度和

8、遠隔臟器的細菌易位率逐漸升高，且在停CPB后4h達高峰，而SH組無明顯變化，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Y組和SDD組血漿中LPS乳酸濃度和遠隔臟器的細菌易位率，與CPB組相比明顯減少(但仍高于SH組)，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 二、各組大鼠血漿和小腸組織sIgA濃度的變化 CPB組和SDD組血漿和小腸組織sIgA濃度明顯降低，與SH組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Y組血漿和小腸組織sIgA濃

9、度均升高，與CPB和SDD組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但仍低于SH組，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 三、血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平變化Y組、SDD組和CPB組血漿TNF-α、IL-6濃度明顯升高，IL-10濃度明顯降低，與SH組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：Y組和SDD組血漿TNF-α和IL-6濃度明顯下降，IL-10濃度明顯升高，與CPB組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

10、CPB組中血漿TNF-α、IL-6水平在CPB60min達高峰(P<0.05)，之后略有下降，停CPB后4h時再次升高；血漿IL-10水平在CPB60min最低，之后略有回升，停CPB后4h再次降低(P<0.05)。 四、各組大鼠腸粘膜形態(tài)學改變 1、HE染色光鏡觀察 SH組大鼠除腸粘膜下層可見少量淋巴細胞浸潤外，未見明顯形態(tài)學改變。CPB組大鼠腸粘膜層變薄，部分絨毛萎縮，絨毛頂部上皮細胞變性、壞死、脫落，固有層

11、出血、水腫，中央乳糜管擴大，淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，停CPB后2h時點改變最顯著。Y組和SDD組小腸粘膜及粘膜下層毛細血管充血減輕，未發(fā)現(xiàn)明顯的粘膜上皮脫落。 2、透射電鏡觀察 SH組大鼠腸上皮細胞微絨毛排列整齊，細胞連接結構正常，細胞器基本正常。CPB組小腸上皮微絨毛脫失，線粒體內質網(wǎng)空泡變性，緊密連接不清，且在停CPB后2h時點改變最為顯著。Y組和SDD組小腸上皮有輕微微絨毛脫失，線粒體內質網(wǎng)空泡變性，但緊密連接較

12、明顯。 五、各組大鼠腸上皮中occludin和ZO-1蛋白表達的變化 1、免疫組化結果 SH組中可見occludin和ZO-1蛋白均勻一致地分布于小腸上皮頂端細胞的邊緣，呈蜂窩狀或線狀。而CPB組的occludin和ZO-1蛋白分布不均，染色變淡，以停CPB后2h改變最為顯著。而Y組和SDD組的改變明顯減輕。 2、Western blot結果 SH組occludin p65和ZO-1p220呈現(xiàn)高

13、密度帶；CPB組兩條帶明顯減弱，活性降低，積分光密度值明顯減少(P<0.05)，以停CPB后2h改變最為顯著。與CPB組比較，Y組和SDD組occludin和Zo-1蛋白表達明顯增強，其差異有統(tǒng)計學意義，但仍低于SH組(P<0.05)。 六、腸上皮緊密連接蛋白表達變化與腸屏障功能的關系 為探討CPB后腸上皮緊密連接蛋白表達的變化與腸粘膜功能的關系，將CPB后腸上皮細胞occludin和ZO-1蛋白的表達和血漿DAO和活性

14、和D-乳酸濃度進行相關分析。結果顯示，緊密連接蛋白表達與血漿DAO和活性和D-乳酸濃度呈負相關(r2=0.8063,0.7312；r2=0.8228，0.8248，P<0.05)。 七、腸上皮緊密連接蛋白表達變化與炎癥介質的關系 為探討CPB對腸上皮緊密連接蛋白表達的影響機制，將CPB后腸上皮細胞occludin和ZO-1蛋白的表達及血漿DAO活性、D-乳酸濃度和血漿TNF-α和IL-6水平變化進行相關分析。結果顯示，緊

15、密連接蛋白表達與血漿TNF-α、IL-6水平呈負相關(r2=0.678，0.6117；r2=0.5530，0.5309，P<0.05)。血漿DAO活性和D-乳酸濃度和血漿TNF-α、IL-6水平正相關(r2=0.5565，0.6934；r2=0.7073，0.5549，P<0.05)。 結論： 1、CPB后腸粘膜上皮緊密連接蛋白表達的下調可能是CPB所致腸粘膜屏障功能損傷的機制之一。 2、益生菌預處理可抑制CPB