瘦素對新生期大鼠反復(fù)長程驚厥性腦損傷的干預(yù)作用及機制探討.pdf

1、目的：探討瘦素長程干預(yù)對大鼠新生期反復(fù)長程驚厥腦損傷的干預(yù)作用和分子機制。
　　方法：日齡6天（P6）的Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，隨機（隨機數(shù)字表法）分成四組，每組10只，即：空白對照組（Control組）、單純瘦素組（Leptin組）、單純驚厥組（RS組）和驚厥加瘦素組（RS+Leptin組）。RS組和RS+Leptin組大鼠使用三氟乙醚反復(fù)誘導(dǎo)驚厥發(fā)作，使驚厥持續(xù)30min，每日一次，連續(xù)7天（P6-P1

2、2），建立新生期大鼠三氟乙醚驚厥模型。于P13時，Leptin組和RS+Leptin組開始瘦素腹腔注射(2mg/kg)，連續(xù)10天。于P23和P30進行神經(jīng)行為學(xué)測試（負(fù)向趨地反射、前肢懸吊反射、懸崖回避反射、平面反正反射及曠場實驗）；P27-P33進行Morris水迷宮逃避潛伏期和探索實驗；定時檢測大鼠體重變化。P34時，分離大腦皮層及海馬，采用免疫印記（Western blot）技術(shù)檢測：鋅離子通道蛋白：ZnT1、ZIP7；質(zhì)膜損傷

3、標(biāo)記蛋白：cPLA2；自噬信號通路相關(guān)蛋白：Beclin-1、Bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Cathepsin E；記憶分子：CaMKⅡα和CaMKⅡβ的表達(dá)情況。采用Neo-Timm’s法檢測海馬苔蘚纖維發(fā)芽情況。
　　結(jié)果：
　　1、體重變化：四組大鼠的體重總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義[F(27,360)=3.099,P<0.05]，進一步比較發(fā)現(xiàn)：P12-P33期間各時間點，RS組與RS+Leptin組體重均較Control

4、組大鼠明顯下降（P<0.05），Leptin組與Control組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、神經(jīng)行為學(xué)評分：（1）負(fù)向趨地反射：P23和P30時，四組評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[FP23(3,16)=168.1,P<0.05;FP30(3,16)=24.84,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組均較Control組時間明顯延長（P<0.05），RS+Leptin組與RS組相比均明顯縮短（P<0.05），趨于正常；（2）前肢懸

5、吊反射：P23和P30時，四組評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[FP23(3,16)=37.15,P<0.05；FP30(3,16)=4.68,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組時間均明顯縮短（P<0.05），P23時，RS+Leptin組較RS組時間均明顯延長（P<0.05），趨于正常；（3）懸崖回避反射：P23和P30時，四組評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義[FP23(3,16)=136.2,P<0.05；FP30(3,16)=

6、12.47,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組時間均明顯延長（P<0.05），RS+Leptin組較RS組時間均明顯縮短（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常；（4）平面反正反射：P23和P30時，四組評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[FP23(3,16)=12.63,P<0.05；FP30(3,16)=16.04,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組時間明顯延長（P<

7、0.05），RS+Leptin組較RS組時間均明顯縮短（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常。
　　3、曠場實驗：（1）延遲時間：P23和P30時，四組評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[FP23(3,16)=15.50,P<0.05；FP30(3,16)=15.50,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組時間明顯延長（P<0.05），RS+Leptin組較RS組時間明顯縮短（P<0.05），

8、與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常；（2）開場得分：P23和P30時四組得分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[FP23(3,16)=182.10,P<0.05；FP30(3,16)=8.80,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組得分明顯降低（P<0.05），RS+Leptin組較RS組得分明顯增加（P<0.05），趨于正常。
　　4、Morris水迷宮：（1）定位航行：two-way ANOVA分析顯示：四

9、組逃避潛伏期總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[F(12,48)=17.52,P<0.05]；進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：試驗第2-4天時，RS組較Control組逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），RS+Leptin組較RS組潛伏期明顯縮短（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常；（2）空間探索試驗：四組穿平臺次數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[F(3,16)=17.71,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組與Control組相比穿平

10、臺次數(shù)明顯減少（P<0.05），RS+Leptin組與 RS組相比穿平臺次數(shù)明顯增加（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常。
　　5、Neo-Timm’s染色：四組海馬CA3區(qū)和齒狀回苔蘚纖維發(fā)芽半定量評分差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義[FCA3(3,16)=21.69,P<0.05；F齒狀回(3,16)=84.51,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組發(fā)芽明顯增加（P<0.05），RS+

11、Leptin組較RS組發(fā)芽明顯減少（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常。
　　6、Western bolt結(jié)果：（1）鋅離子通道蛋白:四組大鼠大腦皮層和海馬鋅離子通道蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義[ZnT1：F皮層(3,16)=24.78,P<0.05；F海馬(3,16)=84.38,P<0.05；ZIP7：F皮層(3,16)=21.17,P<0.05；F海馬(3,16)=14.48,P<0.05]，進

12、一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組表達(dá)均明顯增加（P<0.05），RS+Leptin組較RS組表達(dá)明顯減少（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常；（2）質(zhì)膜損傷標(biāo)記蛋白cPLA2：四組大鼠大腦皮層和海馬表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義[F皮層(3,16)=62.23,P<0.05；F海馬(3,16)=35.71,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組表達(dá)均明顯增加（P<0.05），RS+

13、Leptin組較RS組表達(dá)明顯減少（P<0.05），與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，趨于正常；（3）自噬信號通路相關(guān)蛋白：四組大鼠大腦皮層和海馬自噬信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義[Beclin-1/Bcl-2：F皮層(3,16)=22.26,P<0.05，F(xiàn)海馬(3,16)=7.202，P<0.05；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ：F皮層(3,16)=16.37,P<0.05，F(xiàn)海馬(3,16)=10.37,P<0.05；Cath

14、epsin E：F皮層(3,16)=34.08,P<0.05，F(xiàn)海馬(3,16)=186.5,P<0.05]，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS組較Control組均明顯升高（P<0.05），RS+Leptin組較RS組明顯降低（P<0.05），趨于正常；（4）記憶分子：CaMKⅡα：四組大鼠大腦皮層和海馬表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義[F皮層(3,16)=284.7,P<0.05；F海馬(3,16)=144.0，P<0.05]，RS組較Control

15、組均明顯降低（P<0.05），進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：RS+Leptin組較RS組明顯升高（P<0.05），趨于正常；CaMKⅡβ：四組大鼠大腦皮層和海馬表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[F皮層(3,16)=0.7919,P>0.05；F海馬(3,16)=0.8002，P>0.05]。
　　結(jié)論:
　　1．瘦素長程干預(yù)能顯著減輕新生期反復(fù)長程驚厥所致神經(jīng)行為、認(rèn)知損傷及海馬苔蘚纖維異常發(fā)芽；
　　2．新生期反復(fù)長程驚厥能顯著上調(diào)遠(yuǎn)期皮