豚鼠膽色素結(jié)石模型的腸道免疫屏障研究.pdf

1、前言: 隨著近年來對腸粘膜屏障功能了解的不斷深入，其在多種疾病中的作用愈來愈引起人們的重視。越來越多的證據(jù)表明，腸粘膜屏障功能的異常及其繼發(fā)的細(xì)菌移位，參與了多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程。在近期對膽色素結(jié)石的研究工作中注意到，飲食誘導(dǎo)的敘利亞金黃地鼠和豚鼠膽囊膽色素結(jié)石形成過程中，腸道屏障功能可能存在異常，研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)成石模型的腸道通透性相對良好，腸粘膜機(jī)械屏障部分破壞。因此可以提出假設(shè)，腸粘膜的生物屏障和免疫屏障是否也同時存

2、在改變，腸道粘膜免疫和生物屏障功能異常是否在膽色素結(jié)石形成的某些環(huán)節(jié)中也發(fā)揮一定作用呢?選用較常用的致石食譜誘導(dǎo)的豚鼠膽囊膽色素結(jié)石動物模型來進(jìn)行觀察。沿著腸屏障功能異常-細(xì)菌移位-膽汁酶學(xué)改變-膽色素結(jié)石形成的線索，對反映腸粘膜屏障功能的腸粘膜形態(tài)學(xué)和腸粘膜免疫屏障功能等系列指標(biāo)進(jìn)行了檢測，以期了解膽色素結(jié)石形成過程與腸粘膜屏障功能異常相關(guān)性的證據(jù)。并進(jìn)一步應(yīng)用腸粘膜保護(hù)劑谷氨酰胺進(jìn)行干預(yù)，觀察其對結(jié)石形成率以及腸道粘膜免疫屏障的影響

3、，旨在從一個新的角度——腸粘膜屏障功能，來探討膽色素結(jié)石的形成機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法: 一、實(shí)驗(yàn)對象 豚鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250g，按照隨機(jī)原則分為三組：對照組(CON組)20只；致石組(PS組)30只；谷氨酰胺組(GLN組)30只；對照組給予普通豚鼠飼料，致石組給予致石飼料喂養(yǎng)，谷氨酰胺組給予添加谷氨酰胺的致石飼料，各飼養(yǎng)8周，觀察各指標(biāo)。 二、標(biāo)本采集 采集鼠末端回腸組織標(biāo)本。

4、 三、檢測指標(biāo) (一) 致石率評定及紅外光譜結(jié)石定性：解剖顯露豚鼠膽囊，肉眼即可清晰辨別膽囊結(jié)石形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法，對結(jié)石成分進(jìn)行定性，統(tǒng)計(jì)結(jié)石形成率。 (二) 腸粘膜細(xì)胞光鏡觀察：取距離回盲部5cm的回腸組織，石蠟包埋，HE染色光鏡下觀察，絨毛的高度，絨毛寬度，分別計(jì)數(shù)4個高倍鏡下(400×)腸粘膜固有層和上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞數(shù)，取其均值。 (三) 免疫組化法標(biāo)記計(jì)數(shù)腸粘膜淋巴細(xì)胞：取距離回盲部5

5、cm的回腸組織，免疫組化法處理，鏡檢棕黃色著色者為陽性細(xì)胞。分別記數(shù)4個高倍鏡下(400×)CD3+T細(xì)胞數(shù)和CD40+B細(xì)胞數(shù)，取其均值。 (四) 免疫組化法標(biāo)記腸粘膜分泌IgA的漿細(xì)胞：取距離回盲部5cm的回腸組織，免疫組化法處理后，鏡檢棕黃色著色者為陽性細(xì)胞。分別記數(shù)4個高倍鏡下(400×)陽性漿細(xì)胞數(shù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、豚鼠膽囊膽色素結(jié)石模型構(gòu)建情況：飼養(yǎng)8周，CON組豚鼠成石率為20％，致石組成石率為6

6、8.4％，使用谷氨酰胺作為腸粘膜保護(hù)劑的GLN組，成石率為36.8％，低于成石組。結(jié)石定性鑒定為膽色素結(jié)石。 2、腸粘膜細(xì)胞光鏡觀察：與CON組相比，PS組腸粘膜細(xì)胞絨毛排列紊亂，腸粘膜出現(xiàn)水腫和少量炎性細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張，腸壁各層變薄，絨毛高度降低，寬度減??；GLN組微絨毛排列略稀疏，水腫炎癥情況較輕。分別計(jì)數(shù)固有層和上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果表明PS組和GLN組的淋巴細(xì)胞數(shù)均要低于CON組；而GLN組的陽性淋巴細(xì)胞高于PS組

7、。 3、免疫組化法標(biāo)記計(jì)數(shù)腸粘膜淋巴細(xì)胞：對各組腸粘膜的CD3+T細(xì)胞數(shù)和CD40+B細(xì)胞數(shù)進(jìn)行記數(shù)，結(jié)果表明PS組和GLN組的陽性T和B淋巴細(xì)胞均要低于CON組；而GLN組的陽性淋巴細(xì)胞高于PS組。鼠回腸末端粘膜層CD3+CD40+陽性淋巴細(xì)胞，IgA+漿細(xì)胞(×400)4、免疫組化法標(biāo)記腸粘膜分泌IgA的漿細(xì)胞：對各組IgA染色陽性的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行記數(shù)，結(jié)果表明PS組和GLN組的陽性漿細(xì)胞數(shù)均要低于CON組；而GLN組的陽性漿細(xì)

8、胞數(shù)高于PS組。 結(jié)論: 1、飲食誘導(dǎo)的豚鼠膽囊膽色素結(jié)石形成過程中，存在腸粘膜機(jī)械屏障和免疫屏障功能異常；膽色素結(jié)石的形成與腸粘膜機(jī)械屏障和免疫屏障功能異常具有一定相關(guān)性。 2、谷氨酰胺可改善成石模型中豚鼠的腸粘膜屏障功能，同時可降低膽色素結(jié)石的形成率。 3、腸屏障功能改變可能參與影響膽色素結(jié)石形成。細(xì)菌移位以及膽汁β-葡萄糖苷酸酶活性改變可能是腸粘膜屏障功能參與影響膽色素結(jié)石形成的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)注意