豚鼠腸黏膜屏障與膽色素結(jié)石關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膽石癥目前在世界上仍然是常見病、多發(fā)病之一。在我國臨床實(shí)踐中，膽固醇結(jié)石好發(fā)于膽囊，膽色素結(jié)石好發(fā)于肝膽管系統(tǒng)，尤以肝內(nèi)膽管常見(占90％以上)。膽囊結(jié)石可手術(shù)切除而治愈，但膽管結(jié)石療效尚不滿意，表現(xiàn)為手術(shù)后結(jié)石殘余率、復(fù)發(fā)率高，手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率和再手術(shù)率較高，那么研究膽色素結(jié)石的發(fā)病原因以及預(yù)防就有了實(shí)際的意義。早在20世紀(jì)50年代就有報道肝內(nèi)膽管結(jié)石源于細(xì)菌感染，可伴膽管狹窄，致病情反復(fù)難愈。膽石癥病人膽汁中細(xì)菌的檢出率高提示了細(xì)菌

2、感染和膽色素結(jié)石形成之間有密切的關(guān)系。但細(xì)菌的來源說法不一，有血源性、返流性、移位性多種學(xué)說，可能同時并存。我們在近期對膽色素結(jié)石的研究工作中注意到，飲食誘導(dǎo)的豚鼠膽囊膽色素結(jié)石形成過程中，腸黏膜屏障中機(jī)械屏障及腸黏膜通透性方面存在異常，這一點(diǎn)提示我們，腸黏膜屏障功能異常在膽色素結(jié)石形成的某些環(huán)節(jié)中發(fā)揮一定的作用。遵循這一邏輯思維，鑒于門靜脈系統(tǒng)的特殊解剖結(jié)構(gòu)，當(dāng)腸黏膜屏障功能發(fā)生異常時，腸道內(nèi)的細(xì)菌是否在某些因素的作用下，透過腸壁、通

3、過血液和淋巴管道，侵及肝膽系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)膽色素結(jié)石的形成?；谝陨舷敕?，我們在飲食誘導(dǎo)的豚鼠膽囊膽色素結(jié)石模型中，用細(xì)菌分類培養(yǎng)的方法，觀察腸道內(nèi)細(xì)菌菌群數(shù)量的變化；用免疫組化的方法，觀察腸黏膜免疫細(xì)胞和分子數(shù)量的變化，借此反應(yīng)腸黏膜免疫功能，并進(jìn)一步應(yīng)用腸黏膜保護(hù)劑谷氨酰胺進(jìn)行干預(yù)。從正反二個方面，來觀察腸黏膜屏障功能與膽色素結(jié)石形成之間的關(guān)系，從一個新的角度來初步探討膽色素結(jié)石的形成機(jī)制和可能的預(yù)防手段。 實(shí)驗(yàn)方法：

4、 一、實(shí)驗(yàn)對象 豚鼠95只，雌性48只，雄性47只，體質(zhì)量210～250g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按照隨機(jī)原則分為四組：對照組(CON組)15只，給予普通豚鼠飼料，飼養(yǎng)8周；致石組(PS組)30只，給予致石飼料，飼養(yǎng)8周；短期致石組(STPS組)20只，給予致石飼料，飼養(yǎng)4周；谷氨酰胺組(GLN組)30只，給予添加谷氨酰胺的致石飼料，飼養(yǎng)8周。各組均處于相同的飼養(yǎng)條件下，投餌量一致。 二、標(biāo)本采集 1、膽囊膽色素結(jié)石

5、標(biāo)本以10％水合氯醛按照3ml/kg腹腔注射麻醉后，將豚鼠固定于解剖臺，腹部高效碘消毒，取腹部正中切口開腹，含膽汁取下膽囊，囊內(nèi)膽汁及膽石可憑肉眼清晰辨別，采用雙盲法操作并記錄成石情況。 2、回腸內(nèi)容物及回腸病理標(biāo)本開腹后，尋找到回盲部，取末端回腸2cm，縱向剖開，收集腸內(nèi)容物后，稱重、放入無菌小瓶中?；啬c標(biāo)本用生理鹽水清洗三遍，用剪刀裁成1cm長的小段，用10％的中性福爾馬林浸泡。每操作一個豚鼠更換一套無菌手術(shù)器械。

6、三、檢測指標(biāo) 1、致石率評定及紅外光譜結(jié)石定性解剖顯露豚鼠膽囊，肉眼即可清晰辨別膽囊結(jié)石形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法，對結(jié)石成分進(jìn)行定性，統(tǒng)計結(jié)石形成率。 2、豚鼠回腸內(nèi)容物細(xì)菌分類培養(yǎng)取回腸內(nèi)容物，依濃度稀釋后在腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌培養(yǎng)基上進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，并計數(shù)。 3、計算腸道細(xì)菌定植抗力雙歧桿菌與腸桿菌的數(shù)量比值(B/E值)。 4、豚鼠腸黏膜免疫細(xì)胞和分子檢測采用免疫組化法，測定

7、腸黏膜內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞的數(shù)量和腸黏膜表面SIgA的含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、豚鼠膽囊膽色素結(jié)石模型構(gòu)建情況飼養(yǎng)8周后，CON組豚鼠偶見結(jié)石形成，PS組成石率為68.42％，GLN組成石率為38.89％，GLN組低于PS組(p<0.05)，另飼養(yǎng)4周的STPS組成石率為36.36％，低于PS組(p<0.05)。結(jié)石定性為膽色素結(jié)石。 2、豚鼠回腸內(nèi)容物細(xì)菌分類培養(yǎng)結(jié)果與CON組相比，PS組腸桿菌、腸球菌

8、的量明顯升高，乳桿菌、雙歧桿菌的量明顯降低(p<0.05)；STPS組腸桿菌的量明顯升高，雙歧桿菌的量明顯降低(p<0.05)；GLN組雙歧桿菌的量明顯降低(p<0.05)。 3、腸道細(xì)菌定植抗力與CON組B/E值(1.770±65)相比，致石組B/E值(1.33±0.31)降低(p<0.05)。 4、豚鼠腸黏膜免疫細(xì)胞和分子檢測與CON組相比，STPS組腸黏膜固有層內(nèi)DC細(xì)胞數(shù)增加，抗原表達(dá)增強(qiáng)、增多(p<0.05)；