小鼠嗅球注射α--synuclein陽性包涵體形成并沿神經(jīng)軸突播散的機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，也是最常見的突觸核蛋白病之一，眾所周知帕金森病典型的病理表現(xiàn)為腦中黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元退行性變和路易小體沉積;α-突觸核蛋白是多巴胺能神經(jīng)元中嗜伊紅染色路易小體(Lewy body，LB)的主要成分[1];路易小體內(nèi)有多種蛋白質(zhì)富集，主要包括α-突觸核蛋白、parkin、泛素等，其中α-突觸核蛋白是其主要成分。神經(jīng)元中α-突觸核蛋白陽性包涵體是其主要的病理改

2、變，即由錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白(alpha-synuclein，α-syn)構(gòu)成的異常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物[2];主要累及黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，還包括去甲腎上腺素能神經(jīng)及腦干、5-HT神經(jīng)元。α-突觸核蛋白是可溶性的蛋白質(zhì)，當(dāng)與膜結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)發(fā)生α-螺旋化的改變。在病理?xiàng)l件下，它會(huì)寡聚化聚集成纖維體，排列成富含β-片層結(jié)構(gòu)的薄片[1，3,4]。Braak[5]等發(fā)現(xiàn)在帕金森病患者不同病程的發(fā)生發(fā)展階段，錯(cuò)誤折疊異常聚集的α-突觸核蛋白在神

3、經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)通過軸突按照一定順序系統(tǒng)播散至大腦的不同區(qū)域:帕金森病患者臨床前期，α-突觸核蛋白主要分布在腸神經(jīng)系統(tǒng)、迷走神經(jīng)背核及嗅球區(qū)域;前驅(qū)期;錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白主要分布在黑質(zhì)、中腦及基底節(jié)區(qū);臨床期:錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白彌散分布在帕金森病患者整個(gè)大腦皮層。之前帕金森病患者尸檢結(jié)果提示大腦中病理標(biāo)志物路易小體(LB)遵循預(yù)測(cè)的解剖部位逐漸蔓延至整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)[5，6]。研究證實(shí)聚集或錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白可在神經(jīng)元之間播散[7

4、]，已經(jīng)提出聚集和錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白可以在人的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以朊蛋白樣方式傳播[8]。然后錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白釋放到細(xì)胞外并被臨近的細(xì)胞再攝取，進(jìn)入新細(xì)胞后，錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白可以進(jìn)一步以“種子α-突觸核蛋白”的形式誘導(dǎo)病理性α-突觸核蛋白表達(dá)增加。即錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)起到一個(gè)模板作用，將導(dǎo)致疾病的病理性蛋白從一個(gè)細(xì)胞傳遞到另一個(gè)細(xì)胞，這種錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的理論有助于帕金森病和其他突觸核蛋白病發(fā)病機(jī)制的研究

5、[9-12]。Braak等[13]學(xué)者的病理研究證實(shí)，α-突觸蛋白最早出現(xiàn)在嗅球，與臨床上帕金森病患者早期出現(xiàn)的嗅覺障礙一致，提示嗅覺障礙與α-突觸蛋白沉積在嗅球關(guān)系密切。以此推測(cè)嗅覺神經(jīng)投射通路是帕金森病患者神經(jīng)系統(tǒng)中病理性α-突觸核蛋白的主要播散途徑，進(jìn)一步研究小鼠嗅球注射α-synuclein陽性包涵體形成并沿神經(jīng)軸突播散的機(jī)制。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠嗅球注射α-synuclein纖維體模型，研究嗅球α-

6、synuclein陽性包涵體形成并沿神經(jīng)軸突播散的機(jī)制。
　　方法：
　　1.制備α-突觸核蛋白纖維體。
　　2.向C57BL/6小鼠嗅球立體定位注射α-突觸核蛋白纖維體，于1天、2天、3天及4天灌注取材。
　　3.分別對(duì)1天、2天、3天及4天的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)各個(gè)層面的組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及雙重免疫熒光組織化學(xué)染色，通過電子顯微鏡和免疫熒光顯微鏡觀察嗅球及其纖維聯(lián)系的腦區(qū)α-突觸核蛋白陽性包涵體在神經(jīng)元、小

7、膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中的形成及播散。
　　結(jié)果：
　　1.透射電鏡下鑒定制備的α-突觸核蛋白纖維體形態(tài)。
　　2.在小鼠嗅球注射α-突觸核蛋白纖維體2天后，在嗅球(OB)、前嗅核(AON)檢測(cè)到α-突觸核蛋白陽性包涵體的形成。
　　3.在小鼠嗅球注射α-突觸核蛋白纖維體4天后，在聯(lián)絡(luò)皮質(zhì)(FrA)和梨形皮質(zhì)(PIR)層面，檢測(cè)到α-突觸核蛋白陽性包涵體的形成。
　　4.α-突觸核蛋白陽性包涵體與神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞