家蠶神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子Robo的功能研究.pdf

1、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)，神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子在此過程中發(fā)揮著重要作用。目前已鑒定到的神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子家族包括Ephrins家族，Netrins家族，Semaphorins家族和Slits家族，這些軸突導(dǎo)向因子可以定位在細胞表面起短距離的排斥或吸引作用，也可以擴散到其它部位起遠距離的排斥或吸引作用。Roundabout(Robo)是神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子Slit的受體，最開始是在果蠅突變基因的大規(guī)模篩選中由于可以介導(dǎo)交叉神經(jīng)元的軸突跨越

2、中線而被鑒定到。Robo在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中線處的軸突導(dǎo)向過程中具有排斥作用，另外能夠促進神經(jīng)元軸突的生長，樹突分支以及調(diào)控神經(jīng)元遷移等過程。對Robo軸突導(dǎo)向機制及在不同組織中分子作用機制的研究是當前研究的熱點。
　　家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，相比果蠅分化程度更高，體積更大，為生物發(fā)育與分子作用機制研究提供了一個具有較強操作性的研究模型。盡管家蠶神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)造相對比較簡單，但是能產(chǎn)生豐富的行為，另外，家蠶的遺傳背景清晰，突變基因資源豐

3、富，這些特點使家蠶成為一種理想的研究動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的載體。目前，家蠶神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子的研究尚處于起步階段，本研究首次在家蠶中克隆到了神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子Robo家族的三個基因，即Bmrobo1a，Bmrobo1b和Bmrobo2/3，分析了家蠶robo基因的進化關(guān)系，并利用免疫熒光染色和RNA干涉等技術(shù)研究了其在家蠶中的功能。本研究對于揭示家蠶神經(jīng)發(fā)育的內(nèi)在分子機制具有重要意義，也為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療及腫瘤的防治提供理論基礎(chǔ)。本研究的主要

4、結(jié)果如下:
　　(1)克隆到家蠶中robo家族的3個成員，Bmrobo1a、Bmrobo1b和Bmrobo2/3。Bmrobo1a和BmRobo1b基因均位于家蠶6號染色體上，Bmrobo2/3基因位于家蠶13號染色體上。Bmrobo1a基因包含15個外顯子和14個內(nèi)含子，CDS總長2931bp，編碼976個氨基酸，Bmrobo1b基因包含17個外顯子和16個內(nèi)含子，CDS序列總長3018bp，編碼1005個氨基酸。Bmrobo2

5、/3包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，CDS總長3624bp，編碼1207個氨基酸。
　　(2)從數(shù)據(jù)庫中搜集Robo序列后利用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)robo基因最早起源于腔腸動物水螅，在進化過程中經(jīng)過多次復(fù)制，最終產(chǎn)生了4個家族成員，即robo1、robo2、robo3以及robo4。
　　(3)制備了家蠶BmRobo1a、BmRobo1b和BmRobo2/3的多克隆抗體。通過構(gòu)建pET-28a重組質(zhì)粒并在大腸桿菌BL2

6、1進行原核表達，對表達的重組蛋白進行純化后注射兔子制備多克隆抗體。Western blotting和ELISA檢測證明抗體質(zhì)量良好且能與抗原發(fā)生特異性的抗原-抗體免疫反應(yīng)。
　　(4)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，家蠶胚胎和5齡第3天幼蟲中BmRobo1a、BmRobo1b和BmRobo2/3在神經(jīng)中線兩側(cè)、大腦和神經(jīng)節(jié)中存在表達，表明其在神經(jīng)發(fā)育中的重要作用。Robo蛋白在家蠶中與配體BmSlit在神經(jīng)系統(tǒng)中存在共定位現(xiàn)象，說明在家蠶中Ro