丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、本研究擬在體外建立合適的紅細(xì)胞氧化損傷模型，研究丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用，并對其保護作用機制進行探討。
　　第一部分:建立和篩選合適的紅細(xì)胞氧化損傷模型
　　采用大鼠紅細(xì)胞建立氧化損傷模型，并對吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate，PMS)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、亞硝酸鈉(sodiumnitrite，NaNO2)等三種氧化劑的作用效果進行篩選。頸動脈采集大鼠血

2、液，離心去除白細(xì)胞，獲得紅細(xì)胞重懸液后分為四組:對照組;PMS組（終濃度為25、50和100μM）;H2O2組（終濃度為0.5、5和8 mM）;NaNO2組（終濃度為0.5、1和1.5 mM）。其中，H2O2組中還需加入終濃度為0.4 mM疊氮化鈉(sodium azide,NaN3)溶液以防止加入的過氧化氫被酶解。37℃水浴1h，用自體血漿調(diào)節(jié)紅細(xì)胞壓積至40％，測定紅細(xì)胞氧化損傷的主要指標(biāo)MetHb含量以及聚集性、變形性等血液流變學(xué)

3、指標(biāo)。
　　結(jié)果表明:三種氧化劑作用紅細(xì)胞后，與基礎(chǔ)值相比MetHb含量均顯著升高（P＜0.05），說明三種氧化劑均使紅細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的氧化損傷。在紅細(xì)胞聚集指數(shù)方面，H2O2組隨濃度升高呈下降趨勢，并在濃度為8 mM時與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;各濃度的PMS和NaNO2對紅細(xì)胞聚集指數(shù)均無明顯影響(P＞0.05)。在紅細(xì)胞聚集時間上，與對照組相比，H2O2作用濃度為5mM和8 mM時聚集時間明顯升高(P＜0.

4、05);PMS對聚集時間無明顯影響;NaNO2作用后聚集時間降低(P＜0.05)，但隨著作用濃度升高聚集時間呈回升趨勢，在濃度為1.5mM時與對照組比無統(tǒng)計學(xué)差異。在紅細(xì)胞變形性方面，H2O2和PMS作用紅細(xì)胞后，不同剪切速率(shear rate，SHR)下的紅細(xì)胞變形性與對照組相比均顯著下降（P＜0.05）;NaNO2作用紅細(xì)胞后，SHR≤100 s-1時，變形性降低(P＜0.05)，但隨著SHR的增大，紅細(xì)胞變形性有升高趨勢，SH

5、R≥600 s-1時，NaNO2組變形性顯著高于對照組(P＜0.05)。
　　小結(jié):MetHb含量和紅細(xì)胞變形性等流變學(xué)指標(biāo)是評價紅細(xì)胞氧化損傷的相關(guān)指標(biāo)，其中MetHb含量反應(yīng)胞內(nèi)血紅蛋白的狀態(tài)，與紅細(xì)胞攜放氧能力相關(guān)，紅細(xì)胞變形性等流變學(xué)指標(biāo)與膜氧化后流動性相關(guān)。本部分研究結(jié)果顯示:三種氧化劑作用紅細(xì)胞均能引起MetHb水平升高，證明其均造成一定程度的氧化損傷。但是三種氧化劑對紅細(xì)胞流變學(xué)特性影響大不相同，其中NaNO2可上調(diào)

6、紅細(xì)胞變形能力，這可能與其作為NO供體的特性有關(guān)。由此可見NaNO2作為氧化劑一方面可使紅細(xì)胞MetHb含量升高，造成紅細(xì)胞氧化損傷;但另一方面，它又可改善紅細(xì)胞變形能力，對紅細(xì)胞起雙向調(diào)節(jié)的作用，其機制較為復(fù)雜，因此我們認(rèn)為NaNO2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化損傷模型不適用于后續(xù)的研究，故選擇PMS和H2O2作為主要氧化劑進行后續(xù)的紅細(xì)胞氧化損傷模型制備。另外根據(jù)MetHb含量確定后續(xù)研究中PMS作用濃度為50μM，H2O2作用濃度為8mM。<

7、br>　　第二部分:丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用
　　應(yīng)用第一部分篩選的氧化劑種類及濃度建立紅細(xì)胞氧化損傷模型，并驗證丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用。頸動脈采集大鼠血液，離心去除白細(xì)胞，獲得紅細(xì)胞重懸液。首先對丙酮酸鈉作用濃度進行篩選（分組為5、10、20、50和100mM），通過作用前后MetHb、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)等的變化

8、確定丙酮酸鈉合適的作用濃度。隨后觀察不同濃度丙酮酸鈉對紅細(xì)胞的保護作用。將紅細(xì)胞重懸液分為兩組:PMS模型組和H2O2模型組。其中每一模型組又設(shè)置不同的作用條件，包括:對照組、氧化損傷組、丙酮酸鈉不同濃度預(yù)處理組等。首先向丙酮酸鈉預(yù)處理組加入相應(yīng)濃度丙酮酸鈉，37℃作用30min，隨后根據(jù)分組加入相應(yīng)氧化劑于37℃作用1h。檢測相關(guān)指標(biāo)變化，其中PMS組檢測指標(biāo)包括MetHb、MDA、GSH、GSH/GSSG比率和谷胱甘肽還原酶(glu

9、tathione reductase，GR); H2O2組檢測指標(biāo)有MetHb、MDA、GSH。
　　結(jié)果表明:不同濃度丙酮酸鈉作用紅細(xì)胞后，MetHb無明顯升高，與對照組比無顯著差異(P＞0.05); MDA隨作用濃度升高明顯下降（P＜0.05），但在丙酮酸鈉為100mM時回升;GSH含量隨作用濃度升高呈上升趨勢，但與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，在丙酮酸鈉為100 mM時有所下降。結(jié)果提示，低濃度丙酮酸鈉對紅細(xì)胞無明顯

10、副作用，100mM的作用濃度下各指標(biāo)異常提示可能該濃度偏高。故確定丙酮酸鈉作用濃度為5、10、20、50mM。
　　使用篩選的濃度觀察丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用。結(jié)果表明PMS作用紅細(xì)胞后，與對照組相比，MetHb、MDA含量升高(P＜0.05)，GSH、GSH/GSSG下降(P＜0.05)，GR無明顯變化（P＞0.05）。丙酮酸鈉預(yù)處理可以顯著降低PMS誘導(dǎo)的MDA水平，且在濃度為20 mM和50 mM時與PMS損傷組相

11、比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;還可升高GSH/GSSG比率，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，各個濃度處理后GSH/GSSG比率與PMS損傷組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);但丙酮酸鈉預(yù)處理對PMS引起的MetHb和GSH變化無明顯影響(P＞0.05)。H2O2作用紅細(xì)胞后，與對照組相比，MetHb、MDA顯著升高(P＜0.05)，GSH顯著下降(P＜0.05)。丙酮酸鈉預(yù)處理可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的MetHb和MDA水平，與H2O2損傷組

12、相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);同時能升高GSH水平，在丙酮酸鈉濃度為20mM和50mM時，與H2O2損傷組比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　小結(jié):通過實驗選擇丙酮酸鈉作用濃度為5、10、20、50mM進行保護作用研究。丙酮酸鈉均能夠降低PMS和H2O2誘導(dǎo)的MDA含量，表明丙酮酸鈉對這兩種氧化劑造成的紅細(xì)胞氧化損傷均具有一定程度保護作用;但是丙酮酸鈉對PMS誘導(dǎo)的MetHb升高無明顯影響，卻能降低H2O2誘導(dǎo)的Met

13、Hb水平，這可能與兩種氧化劑不同的作用機制有關(guān)，這也提示我們丙酮酸鈉在H2O2引起的紅細(xì)胞氧化損傷模型中保護作用較明顯。因此，在后續(xù)的實驗中選用H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型研究丙酮酸鈉對紅細(xì)胞保護作用的機制。
　　第三部分:丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用機制探討
　　以H2O2造成的紅細(xì)胞氧化損傷模型為主要研究對象，探討丙酮酸鈉對紅細(xì)胞氧化損傷保護作用的機制。頸動脈采集大鼠血液，離心去除白細(xì)胞，獲得紅細(xì)胞重懸液。將紅細(xì)胞重

14、懸液分為:對照組，即沒有任何處理;H2O2損傷組，即只進行氧化損傷誘導(dǎo);保護組，即采用不同濃度丙酮酸鈉預(yù)處理后再誘導(dǎo)氧化損傷，丙酮酸鈉作用濃度分別為5、10、20、50 mM。首先向保護組加入相應(yīng)濃度丙酮酸鈉，37℃作用30 min，隨后向損傷組和保護組加入H2O2，于37℃作用1h。檢測相關(guān)指標(biāo)變化，包括ROS生成量，紅細(xì)胞功能指標(biāo)P50，糖代謝指標(biāo)2，3-DPG(2，3-diphosphoglycerate)、ATP水平和Na+-K

15、+ATP酶活力以及代謝關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(lactate dehydrohenase，LDH)活力。
　　結(jié)果表明:與對照組相比，H2O2作用紅細(xì)胞后，ROS水平上升，2，3-DPG和P50下降，ATP含量下降，Na+-K+ATP酶和LDH活力受到抑制(P＜0.05)。丙酮酸鈉預(yù)處理可以減少ROS含量，在濃度為50 mM時與損傷組比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);與損傷組相比，丙酮酸鈉濃度為10 mM和20 mM時可明顯恢復(fù)LDH活性

16、（P＜0.05）;各個濃度丙酮酸鈉預(yù)處理均可升高ATP水平（P＜0.05）;濃度為20 mM和50mM的丙酮酸鈉可明顯恢復(fù)Na+-KATP酶活力(P＜0.05)，升高2，3-DPG水平（P＜0.05），還可提高P50（P＜0.05）。
　　小結(jié):首先，丙酮酸鈉能夠抑制ROS生成，直接降低H2O2對紅細(xì)胞的損傷;其次，丙酮酸鈉能夠提高LDH活力，促進紅細(xì)胞糖酵解途徑，恢復(fù)ATP水平，減輕紅細(xì)胞氧化損傷。丙酮酸在轉(zhuǎn)換為乳酸的過程中能夠

17、升高NAD+/NADH，NAD+升高有助于2，3-DPG生成，因此我們認(rèn)為丙酮酸鈉可促進2，3-DPG支路進行，提高2，3-DPG產(chǎn)量。作為糖酵解途徑中一個側(cè)支循環(huán)的產(chǎn)物，2，3-DPG是調(diào)節(jié)血紅蛋白攜放氧功能的重要因素。2，3-DPG可與脫氧血紅蛋白結(jié)合，降低血紅蛋白對O2的親和力，增加氧的釋放。本實驗也表明丙酮酸鈉預(yù)處理能夠升高2，3-DPG含量，從而升高P50，改善紅細(xì)胞功能，發(fā)揮紅細(xì)胞保護作用。丙酮酸鈉對紅細(xì)胞不同的糖代謝途徑起